一种应用于NGS平台的超微量核酸样本建库方法技术

本申请公开了一种应用于NGS平台的超微量核酸样本建库方法。本申请的超微量核酸样本建库方法包括，在对超微量核酸样本进行DNA提取前，向超微量核酸样本中加入核酸修复酶，进行核酸修复；然后对含有核酸修复酶的超微量核酸样本进行DNA提取；对提取的DNA进行文库构建，获得超微量核酸样本的测序文库。本申请的超微量核酸样本建库方法，在进行DNA提取之前，对样本DNA进行核酸酶修复；并且，在DNA提取的过程中添加核酸修复酶；能有效修复DNA损伤，降低反应假阳性，提高DNA提取质量，使得构建的文库能更好适用于NGS测序。本申请的建库方法解决了FFPE样本提取的DNA质量差总量低，无法有效建库的问题。库的问题。库的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种应用于NGS平台的超微量核酸样本建库方法


[0001]本申请涉及高通量测序
，特别是涉及一种应用于NGS平台的超微量核酸样本建库方法。

技术介绍

[0002]二代测序(NGS)系统因其可同时进行大量平行测序反应而广为人知。虽然不同的二代测序平台在技术细节上有许多不同，但在测序前都需要建立文库。而低质量的核酸样本，例如福尔马林固定石蜡包埋(Formalin
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Fixed and Paraffin
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Embedded，缩写FFPE)的样本，即FFPE样本，在建立文库时存在诸多问题。
[0003]FFPE样本，作为生物和医学领域的重要样本来源，广受研究者的青睐。但由于多种因素影响，一般从FFPE尤其是穿刺组织制成的FFPE样本中难以获得高质量且足量的DNA。所以如何通过穿刺切片样本中获得的DNA建立合格的文库已成为当前测序研究领域亟待解决的问题。
[0004]常规NGS平台建库包括，首先提取样本中的DNA，然后对DNA进行片段化并纯化，再依序进行末端修复、加A和纯化、接头连接和纯化双筛、pre
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PCR和纯化、杂交捕获和洗脱、post
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PCR和纯化等步骤。可高通量检测多种基因突变。但是每一步反应进行纯化损失大量DNA，样本分子多样性受影响；因此要求高建库起始量。而针对大量穿刺切片样本或显微切割的石蜡样本无法满足高建库起始量，因此亟需研发一种应用于NGS平台的超微量核酸样本建库方法。

技术实现思路

[0005]本申请的目的是提供一种改进的应用于NGS平台的超微量核酸样本建库方法。
[0006]为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
[0007]本申请公开了一种应用于NGS平台的超微量核酸样本建库方法，包括在对超微量核酸样本进行DNA提取之前，向超微量核酸样本中加入核酸修复酶，对微量核酸样本进行核酸修复；然后对含有核酸修复酶的超微量核酸样本进行DNA提取；对提取的DNA进行文库构建，获得超微量核酸样本的测序文库。
[0008]需要说明的是，本申请的超微量核酸样本建库方法，在进行DNA提取之前，对样本DNA进行核酸酶修复；并且，在DNA提取的过程中，都有核酸修复酶存在；能够有效的修复超微量核酸样本的DNA损伤，提高超微量核酸样本提取的DNA的质量，解决了提取的DNA质量差总量低，无法有效建库的问题。可以理解，本申请的关键之一是采用核酸修复酶对超微量核酸样本的DNA进行损伤修复；至于DNA提取的具体过程可以参考现有的超微量核酸样本DNA提取试剂盒，后续的测序文库建库也可以参考现有的文库构建流程；在此不作具体限定。但是，为了进一步提高超微量核酸样本的建库质量，本申请优选的方案中，对后续的建库流程也进行了改进，详见以下技术方案。
[0009]优选的，本申请的超微量核酸样本建库方法中，核酸修复酶为UDG酶，采用UDG酶进
行核酸修复的反应条件为，50℃恒温孵育至少1小时。
[0010]需要说明的是，UDG酶只是本申请的一种实现方式中具体采用的核酸修复酶，不排除还可以采用其它类似功能的核酸修复酶，在此不作具体限定。其中，50℃恒温孵育至少1小时，也是本申请的一种实现方式中具体采用的反应条件；因为，UDG酶的最佳反应温度是50℃；可以理解，基于其它目的，也可以在此基础上进行温度和孵育时间的调整，只要能够起到核酸修复作用即可。
[0011]优选的，本申请的超微量核酸样本建库方法中，对提取的DNA进行文库构建，具体包括，对提取的DNA进行酶切、末端修复和加A组合在一起的一步法反应；然后，对反应产物依序进行加接头和纯化、Pre
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PCR扩增和纯化、杂交捕获、post
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PCR和纯化，即获得所述超微量核酸样本的测序文库。
[0012]需要说明的是，本申请的酶切、末端修复和加A组合在一起的一步法反应是指，在本申请的一种实现方式中，在反应体系中添加酶切、末端修复和加A的所有反应试剂，在一个反应中同步进行酶切、末端修复和加A；这样不仅节省了程序，而且减少了酶切后纯化的步骤；步骤精简，不仅提高了DNA利用效率、降低DNA损失，而且能够更好的保存分子的多样性。
[0013]优选的，本申请的超微量核酸样本建库方法还包括，在进行Pre
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PCR扩增之前，对加接头纯化产物进行定量检测，根据定量检测结果确定Pre
‑
PCR扩增循环数，然后再进行Pre
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PCR扩增。
[0014]需要说明的是，本申请创造性的根据加接头纯化产物的定量结果确定Pre
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PCR扩增的循环数，而不是根据DNA的原始投入量；这样更加准确和有针对性，采用最佳的扩增循环数，能够有效的提高建库质量。
[0015]优选的，本申请的超微量核酸样本建库方法中，超微量核酸样本为FFPE样本。
[0016]需要说明的是，FFPE样本是生物和医学领域比较常见的超微量核酸样本，也是本申请的一种实现方式中具体采用的样本。可以理解，本申请的建库方法不仅仅适用于FFPE样本，也可以用于其它超微量核酸样本，例如法医或其它领域获得的高度腐烂或损伤的样本、考古获得的古生物样本或其它生物样本等，在此不作具体限定。
[0017]优选的，本申请的超微量核酸样本建库方法中，在向FFPE样本中加入核酸修复酶进行核酸修复之前，对FFPE样本进行预处理；该预处理包括，刮取FFPE样本，加入脱蜡液，充分混合后56℃孵育；孵育完成后加入RNase
‑
free water和蛋白酶K，56℃消化4小时以上，然后90℃灭活；灭活完成后，在温度降至石蜡凝固之前，提取下层的澄清液，即获得预处理的FFPE样本，向提取的下层澄清液中加入核酸修复酶进行核酸修复。
[0018]需要说明的是，本申请的FFPE样本预处理就是在有利的环境或条件下去除石蜡，本申请优选的加入RNase
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free water和蛋白酶K进行消化处理，为后续的核酸酶修复和DNA提取奠定基础。
[0019]基于本申请的超微量核酸样本建库方法，本申请的另一面公开了一种特征针对FFPE样本的建库方法，具体包括以下步骤，
[0020](1)刮取FFPE样本，对FFPE样本进行预处理，去除石蜡；
[0021](2)向预处理的FFPE样本中加入核酸修复酶进行核酸修复；
[0022](3)对含有核酸修复酶的FFPE样本进行DNA提取；
[0023](4)对提取的DNA进行酶切、末端修复和加A组合在一起的一步法反应；
[0024](5)对步骤(4)的反应产物进行加接头，并对加接头产物进行纯化；
[0025](6)对步骤(5)的纯化产物进行定量检测；
[0026](7)根据步骤(6)定量检测的结果确定Pre
‑
PCR扩增循环数，进行Pre
‑
PCR扩增，并对Pre...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种应用于NGS平台的超微量核酸样本建库方法，其特征在于：包括在对超微量核酸样本进行DNA提取之前，向超微量核酸样本中加入核酸修复酶，对微量核酸样本进行核酸修复；然后对含有核酸修复酶的超微量核酸样本进行DNA提取；对提取的DNA进行文库构建，获得超微量核酸样本的测序文库。2.根据权利要求1所述的超微量核酸样本建库方法，其特征在于：所述核酸修复酶为UDG酶，采用UDG酶进行核酸修复的反应条件为，50℃恒温孵育至少1小时。3.根据权利要求1所述的超微量核酸样本建库方法，其特征在于：所述对提取的DNA进行文库构建，具体包括，对提取的DNA进行酶切、末端修复和加A组合在一起的一步法反应；然后，对反应产物依序进行加接头和纯化、Pre
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PCR扩增和纯化、杂交捕获、post
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PCR和纯化，即获得所述超微量核酸样本的测序文库。4.根据权利要求3所述的超微量核酸样本建库方法，其特征在于：还包括，在进行Pre
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PCR扩增之前，对加接头纯化产物进行定量检测，根据定量检测结果确定Pre
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PCR扩增循环数，然后再进行Pre
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PCR扩增。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的超微量核酸样本建库方法，其特征在于：所述超微量核酸样本为FFPE样本。6.根据权利要求5所述的超微量核酸样本建库方法，其特征在于：在向FFPE样本中加入核酸修复酶进行核酸修复之前，对FFPE样本进行预处理；所述预处理包括，刮取FFPE样本，加入脱蜡液，充分混合后56℃孵育；孵育完成后加入RNase
‑
free water和蛋白酶K，56℃消化4小时以上，然后90℃灭活；灭活完成后，在温度降至石蜡凝固之前，提取下层的澄清液，即获得预处理的FFPE样本，向提取的下层澄清液中加入核酸修复酶进行核酸修...

【专利技术属性】
技术研发人员：许明炎，张晓妮，刘园园，
申请(专利权)人：深圳市海普洛斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：