一种检测唾液酸化糖链抗原KL-6铱纳米点电化学发光传感器的制备及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种检测唾液酸化糖链抗原KL

【技术实现步骤摘要】
一种检测唾液酸化糖链抗原KL
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6铱纳米点电化学发光传感器的制备及应用


[0001]本专利技术属于纳米材料领域与生物传感


技术介绍

[0002]作为一门由生物、化学、医学、电子技术等多种学科相互交叉而兴起的研究热点，电化学发光免疫分析是电化学发光技术与免疫分析方法的有机结合，制得的免疫传感器具有成本低、选择性好、灵敏度高、分析速度快，易于自动化、微型化与集成化等优点，已被广泛应用于疾病标志物分析、食品安全分析、环境污染分析等领域。
[0003]间质性肺疾病具有发病人群广泛、隐匿性强、病程长、发病机制复杂、诊断治疗存在较大难度等特点。此类疾病会导致肺部器官的损伤及相应的功能障碍，已成为近年来临床关注的热点和难点问题。支气管镜检查和外科肺活检不适合短期内反复检查，肺功能检查需要患者配合程度高，且影响因素多，不适合重症患者常规检测。由此可见，寻找一种可以用于ILD诊断及病情监测的血清无创生物学指标至关重要。唾液酸化糖链抗原KL
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6作为一种用于检测间质性肺疾病的全新的疾病标志物，具有高特异性、高灵敏的特点，可用于间质性肺疾病的辅助诊断。然而，与其有关的免疫分析方法鲜有报道。因此，基于电化学发光免疫分析的优越性，发展一种简单、快速、准确的电化学发光免疫传感器用于测定唾液酸化糖链抗原KL
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6，具有重要的研究意义与临床应用价值。
[0004]近年来，磷光过渡金属配合物的设计与合成成为研究热点。铱类配合物作为配合物家族中最大的一类，在有机电致发光器件的研制中有着广泛应用。凭借极高的电化学发光效率，以双(2
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苯基吡啶)乙酰丙酮铱Ir(ppy)2(acac)为代表的铱配合物在生物分析领域开始受到关注。但是，Ir(ppy)2(acac)水溶性差、易团聚、生物相容性差，极大地限制了其在水相免疫分析中的应用。

技术实现思路

[0005]（1）本专利技术的目的之一是克服以上缺点，制备一种水溶性好、生物相容性好、电化学发光效率高的铱纳米点，以抗体标记的铱纳米点溶液作为信号探针，研制一种无标记型电化学发光免疫传感器；（2）本专利技术的目的之二是提供所述免疫传感器的用途，用于间质性肺疾病标志物唾液酸化糖链抗原KL
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6浓度的检测，传感器信号响应迅速、灵敏度高，大大缩短了检测时间，节省了人力、物力、财力，检出限为45 fg/mL，线性范围100 fg/mL
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50 ng/mL。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种检测唾液酸化糖链抗原KL
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6铱纳米点电化学发光传感器的制备及应用，包括以下步骤：1. 铱纳米点溶液的制备室温下，将质量为10 ~ 20 mg的铱配合物固体溶解于1 ~ 4 mL四氢呋喃中，配置
成质量浓度为5 ~10 mg/mL的溶液；将摩尔浓度为0.1 ~ 0.3 mol/L的氢氧化钠溶液与质量浓度为0.5 ~ 1.0 mg/mL的去铁蛋白溶液，按照一定体积比震荡均匀，在室温下持续搅拌2 ~ 4 h使去铁蛋白结构单元完全解离成游离的子单元；然后，向其中逐滴加入0.5 ~ 1.5 mL、质量浓度为5 ~10 mg/mL的铱配合物溶液，持续搅拌2 ~ 4 h后，迅速向混合溶液中加入0.1 ~ 0.3 mL、摩尔浓度为0.1 ~ 0.3 mol/L 的盐酸溶液对溶液进行中和；待将混合液静止2 ~ 4 h后，用超滤离心管对产物进行分离、纯化，将最终制得的铱纳米点分散至5 ~ 7 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中保存备用；所述铱配合物为双(2
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苯基吡啶)乙酰丙酮铱Ir(ppy)2(acac)；所述去铁蛋白为生物素标记的马脾脏去铁蛋白；所述氢氧化钠与去铁蛋白的溶液体积比为1:100。
[0007]2. 抗体标记的铱纳米点溶液的制备向1 mL铱纳米点溶液中加入50 ~ 70 μL、质量分数为30%的戊二醛，500 ~ 700 μL抗体标准溶液（10 μg/mL），在4
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C下孵化12 ~ 24 h后，通过离心分离得到抗体标记的铱纳米点溶液，置于4
ꢀ°
C下储存备用；3. 一种检测唾液酸化糖链抗原KL
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6铱纳米点电化学发光传感器的制备a. 将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；b. 在玻碳电极表面滴涂6 μL、浓度为2 ~ 3 mg/mL的抗体标记的铱纳米点溶液，将其置于37
ꢀ°
C晾干；c. 滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4
ꢀ°
C晾干；d. 滴加6 μL、浓度为10 μg/mL或未知浓度的间质性肺疾病标志物唾液酸化糖链抗原KL
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6溶液，将其置于37
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C孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，免疫传感器构建完毕；4. 一种铱纳米点电化学发光免疫传感器用于检测间质性肺疾病标志物唾液酸化糖链抗原KL
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6，操作步骤如下：（1）参数设置：超微弱电化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 1.0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含25 ~ 45 mmol/L 三乙胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电化学发光测试，得到孵化不同浓度唾液酸化糖链抗原KL
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6时对应的电化学发光信号强度，绘制工作曲线（检出限为45 fg/mL，线性范围100 fg/mL
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50 ng/mL）；（3）对孵化未知浓度唾液酸化糖链实际样品的传感器进行测试，据此根据工作曲线计算即可得到该实际样品中的唾液酸化糖链浓度。
[0008]本专利技术的有益成果（1）首次提出一种在去铁蛋白内部高效封装铱配合物分子的方法，制得一种水溶性好、电化学发光效率高的铱纳米点看，解决了铱配合物在水相中水溶性差、生物相容性差的问题；（2）以抗体标记的铱纳米点溶液作为信号探针，研制一种无标记型电化学发光免
疫传感器，用于检测间质性肺疾病标志物唾液酸化糖链抗原KL
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6；（3）弥补了目前唾液酸化糖链抗原KL
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6电化学发光检测方法的空白，在实际样品检测中，该免疫传感器检出限低至45 fg/mL，线性范围宽至100 fg/mL
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50 ng/mL；（4）研制的免疫传感器具有制备简单、易操作、信号响应迅速、重现性好、绿色环保无污染等优点，对血清中唾液酸化糖链抗原KL
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6特异性强，在间质性肺疾病的早期诊断中有着巨大的潜在应用。
具体实施方式
[0009]下面结合具体实施例，进一步阐述本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测唾液酸化糖链抗原KL
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6铱纳米点电化学发光传感器的制备及应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）铱纳米点溶液的制备室温下，将质量为10 ~ 20 mg的铱配合物固体溶解于1 ~ 4 mL四氢呋喃中，配置成质量浓度为5 ~10 mg/mL的溶液；将摩尔浓度为0.1 ~ 0.3 mol/L的氢氧化钠溶液与质量浓度为0.5 ~ 1.0 mg/mL的去铁蛋白溶液，按照一定体积比震荡均匀，在室温下持续搅拌2 ~ 4 h使去铁蛋白结构单元完全解离成游离的子单元；然后，向其中逐滴加入0.5 ~ 1.5 mL、质量浓度为5 ~ 10 mg/mL的铱配合物溶液，持续搅拌2 ~ 4 h后，迅速向混合溶液中加入0.1 ~ 0.3 mL、摩尔浓度为0.1 ~ 0.3 mol/L 的盐酸溶液对溶液进行中和；待将混合液静止2 ~ 4 h后，用超滤离心管对产物进行分离、纯化，将最终制得的铱纳米点分散至5 ~ 7 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中保存备用；（2）抗体标记的铱纳米点溶液的制备向1 mL铱纳米点溶液中加入50 ~ 70 μL、质量分数为30%的戊二醛，500 ~ 700 μL抗体标准溶液（10 μg/mL），于4
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C下孵化12 ~ 24 h，离心分离得到抗体标记的铱纳米点溶液，置于4
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C下储存备用；（3）一种铱纳米点电化学发光传感器的制备步骤a. 将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；b. 在玻碳电极表面滴涂6 μL、浓度为2 ~ 3 mg/mL的抗体标记的铱纳米点溶液，将其置于37
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C晾干；c. 滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4
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C晾干；d. 滴加6 μL、浓度为10 μg/mL或未知浓度的间质性肺疾...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜宇，任祥，吴丹，刘雪静，范大伟，魏琴，鞠熀先，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：