本发明专利技术公开了一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的引物组、试剂盒及其方法，所述引物组最少包括两组引物的核苷酸序列，所述多个基因为eIF3A基因组，还包括还包括Buffer PKD、蛋白酶K和Buffer RPE组成的试剂盒。本发明专利技术发现eIF3A基因拷贝数扩增的患者的进展生存期比eIF3A基因没有拷贝数扩增的患者显著延长；eIF3A基因拷贝数扩增的患者总体生存期比eIF3A基因没有拷贝数扩增的患者延长，本方法准确性高、灵活性强、检测周期短。检测周期短。检测周期短。
【技术实现步骤摘要】
一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的引物组、试剂盒及其方法
[0001]本专利技术是涉及生物医药
，具体地说是涉及一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的引物组、试剂盒及其方法。
技术介绍
[0002]据医学统计显示，肿瘤的发生并不是随机的，乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌等多种癌症都具有显著的家族聚集性。原癌基因的活化和抑癌基因的灭活突变，在癌变过程中起着核心的生物学作用。人类癌症的主要危险因素是环境因子，而与此相关基因的遗传多态性决定了个体对这些因素的易感性。随着家族中肿瘤患者的增加和发病年龄的低龄减小化，肿瘤易感性强度也随之增加，此种易感性强度随着家族基因多态性遗传，增加了家族成员患癌风险。
[0003]在2016年的《现代医学生物进展》的期刊上刊登了一篇名为“eIF3a与肿瘤发生、演进和干预的研究进展”的文章，该文章表示：eIF3a通过调控一系列与肿瘤的生成、细胞周期的调控DNA修复等过程相关的mRNA的翻译从而在肿瘤的发生、演进和干预中发挥重要作用。此外，研究发现eIF3a对RAF
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MEK
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ERK信号通路有抑制作用。eIF3a对蛋白质翻译的调节及其对RAF
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MEK
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ERK信号通路的影响使其有望成为肿瘤治疗的新靶点。
[0004]不同的人在相同的环境下抑癌基因易感性存在个体差异，综合利用现代科学研究成果，开发一种直接扩增检测口腔肿瘤生存相关的引检测方式具有明确的市场需求，检测意义明确，适用范围广，而且具有可行性，可用于制定群体的肿瘤预防措施和高危行业的劳动保障措施具有很强的社会意义和市场前景。因此利用现有科学、技术研究成果来开发这样一个产品，是非常需要的。
技术实现思路
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的引物组、试剂盒及其方法，对eIF3A基因扩增对口腔肿瘤无进展生存期的影响进行分析，发现了多个极具信息的可用于检测口腔肿瘤患者生存周期的基因标志物。
[0006]一种同时扩增多个基因的引物组，所述引物组最少包括两组引物的核苷酸序列，所述的两组引物的核苷酸序列的分别如下所述：前引物为：5
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‑3’
和后引物：5
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，所述多个基因为eIF3A基因组。
[0007]本专利技术还提供一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的试剂盒，包括如上所述的引物组，还包括Buffer PKD、蛋白酶K和Buffer RPE。
[0008]本专利技术还提供一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的检测方法：使用了如上所述的试剂盒。
[0009]优选地，所述方法使用了PRC扩增，所述检测样品为刮取石蜡组织标本或者新鲜组
织标本，包括以下步骤：
[0010]S1：将检测样品切片放入1.5ml离心管中，加1ml二甲苯，涡旋10秒，然后在20
‑
25℃条件下，以132000rpm离心2分钟；
[0011]S2：吸弃上清液，往沉淀中加入1ml无水乙醇，涡旋混匀，132000rpm，20
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25℃离心2分钟，再吸弃上清液，打开管盖，室温10分钟，使乙醇挥发干净；
[0012]S3：加入150ul Buffer PKD，10ul蛋白酶K，重悬沉淀，涡旋混匀，分别55℃，15分钟；80℃，15分钟；
[0013]S4：加入320ul Buffer RBC，充分混匀，转移至含2ml收集管的gDNA结合柱，13000rpm,离心30秒，保留流出液；
[0014]S5：向流出液中加入720ul无水乙醇，反复吹打混匀，将700ul样品转移至含2ml收集管进行Rneasy MinElute spin colum，13000rpm，离心15秒，舍弃流出液，重复操作直至所有的样品gDNA结合柱；
[0015]S6：向RNA结合柱中加入500ul Buffer RPE，盖上管盖，13000rpm，离心15秒，洗膜，摒弃流出液；向RNA结合柱中加入500ul Buffer RPE，盖上管盖，13000rpm，离心2分钟，洗膜，弃流出液；将Rneasy MinElute spin colum放入干净的1.5ml收集管中，直接将20ul RNase
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free水加至膜上，盖上管盖，13200rpm，离心1分钟，洗脱RNA；
[0016]S7：进行RNA的逆转录，11ul RNA模板，加1ul随机引物，混匀，将液体离心至管底，放入PCR仪，65℃，5分钟；
[0017]S8：基于S7，在实验过程中加液，依次加入：5xreaction buffer 4μL；RNase inhibitor(20u/ul)1μL；10mM dNTP Mix 2μL；M
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MuLV Reverse Transcriptase(200u/ul)1μL；Total volume per reaction 8μL，分成四组，分别为25℃,5分钟；42℃,60分钟；70℃，5分钟；4℃，5分钟；
[0018]S9：进行RNA的定量化，包括：将cDNA稀释10倍，取2ulcDNA稀释，加18ul ddH2O，配置Mix：ddH2O 7μL，2x Quantitative Reaction Mix 10μL，RRM1/ACTB Forward and Reverse primer 0.5μL+0.5ul，Total volume per reaction 18ul，再将反应液加入PCR反应管进行检测。
[0019]优选地，所述反应液加入PCR反应管进行检测的步骤包括：PCR预变性程序和PCR扩增溶解反应程序，所述PCR预变性程序为95℃，5min；PCR扩增溶解反应程序为：95℃，10s，循环40次；60℃，15s，循环40次；72℃，20s，循环40次，再应用分析软件，给出CP(CT)值，根据计算公式得出基因的相对表达量E。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0021](1)由本专利技术的方法可以看出，在口腔肿瘤患者中，eIF3A基因拷贝数扩增的患者的进展生存期比eIF3A基因没有拷贝数扩增的患者显著延长；eIF3A基因拷贝数扩增的患者总体生存期比eIF3A基因没有拷贝数扩增的患者延长，本方法准确性高、灵活性强、检测周期短。
附图说明
[0022]图1为本专利技术的CP(CT)值示意图。
[0023]图2为本专利技术的eIF3a mRNA表达水平与eIF3a的拷贝数的关系图。
具体实施方式
[0024]下面结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步说明。
[0025]图1中从左至右的CP值依次为：
①
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种同时扩增多个基因的引物组，其特征在于：所述引物组最少包括两组引物的核苷酸序列，所述的两组引物的核苷酸序列的分别如下所述：前引物为：5
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和后引物：5
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，所述多个基因为eIF3A基因组。2.一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的引物组，还包括Buffer PKD、蛋白酶K和Buffer RPE。3.一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的检测方法，其特征在于：使用了权利要求2的试剂盒。4.根据权利要求3所述的一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的检测方法，其特征在于：所述方法使用了PRC扩增，所述检测样品为刮取石蜡组织标本或者新鲜组织标本，包括以下步骤：S1：将检测样品切片放入1.5ml离心管中，加1ml二甲苯，涡旋10秒，然后在20
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25℃条件下，以132000rpm离心2分钟；S2：吸弃上清液，往沉淀中加入1ml无水乙醇，涡旋混匀，132000rpm，20
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25℃离心2分钟，再吸弃上清液，打开管盖，室温10分钟，使乙醇挥发干净；S3：加入150ul Buffer PKD，10ul蛋白酶K，重悬沉淀，涡旋混匀，分别55℃，15分钟；80℃，15分钟；S4：加入320ul Buffer RBC，充分混匀，转移至含2ml收集管的gDNA结合柱，13000rpm,离心30秒，保留流出液；S5：向流出液中加入720ul无水乙醇，反复吹打混匀，将700ul样品转移至含2ml收集管进行Rneasy MinElute spin colum，13000rpm，离心15秒，舍弃流出液，重复操作直至所有的样品gDNA结合柱；S6：向RNA结合柱中加入500ul Buffer R...
【专利技术属性】
技术研发人员：王丹玲，江勇，郭成贤，
申请(专利权)人：长沙深宇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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