筛选微卫星位点的方法及其应用技术

本发明专利技术提出一种筛选微卫星位点的方法，该方法包括：(1)对已知微卫星稳定性状态的样本进行测序，以便获得包含待分析微卫星位点的测序读段；(2)基于所获得的测序读段，采用下列两种方式至少之一进行微卫星位点的筛选：(a)将所述测序读段与参考序列进行比对，获得包含所述待分析微卫星位点的测序读段的读段数目及读段长度，获得目标微卫星位点；和(b)基于包含待分析微卫星位点的测序读段在所述已知微卫星稳定性状态的样本中的step

【技术实现步骤摘要】
筛选微卫星位点的方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体地，涉及筛选微卫星位点的方法及其应用，更具体地，涉及标记物组、探针组及试剂盒。

技术介绍

[0002]微卫星序列是基因组上以数个短的DNA基序(1
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10bp)重复串联而成的序列，其在基因组上的位置为该微卫星的位点。
[0003]微卫星不稳定性(MSI)是指在肿瘤DNA中存在而在胚系DNA中不存在的微卫星序列长度变化，具体表现为微卫星位点的序列上存在的插入或缺失。MSI反映的是DNA错配修复机制(MMR)的缺失。在正常人体中，hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2及hEPCAM等MMR基因会修复基因组上的插入或缺失。当MMR相关基因突变或缺失时，MMR失去对基因组进行修复的能力，表现出基因组上的插入、缺失累积的现象。这种插入、缺失在微卫星位点表现为MSI。在遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC,亦称Lynch综合征)中，MSI常见于hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2及hEPCAM等基因的突变个体中。而在其它肺癌、消化道癌、子宫内膜癌及卵巢癌中的偶发MSI则多由hMLH1启动子的过度甲基化导致该基因无法转录而失活造成。
[0004]MSI在不同肿瘤中的发生率差别显著。MSI是Lynch综合征的特征之一，发生率超过90％。在结直肠癌中，发生率可达15％，而在早发性结直肠癌中则达到30％。
[0005]研究表明，结直肠癌患者有MSI特征的可以获益于5FU
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辅助的化疗。另外，MSI状态的分析也有助于疑似Lynch综合征的判定。因此，在2011年美国国家肿瘤综合网络(NCCN)结直肠癌筛查指南中正式将MSI检测列为首要检测项目。在2019年结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识中则推荐：所有结直肠癌患者均应进行MSI状态筛查；晚期实体瘤患者(如胃癌、小肠癌、子宫内膜癌、尿路上皮癌、胰腺癌和胆管癌等)如考虑免疫治疗应进行MSI状态检测。
[0006]研究表明，MSI检测可用于指导肿瘤免疫治疗。多项研究显示微卫星高度不稳定型(MSI
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H)较微卫星低度不稳定型(MSI
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L)和微卫星稳定型(MSS)的患者接受PD
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1抗体治疗后效果更好。2017年5月，美国FDA加速批准了免疫治疗药物派姆单抗(Pembrolizumab，Keytruda)用于具有MSI
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H或DNA错配修复缺陷的不可切除或转移性实体瘤患者。截至2019年底，已经有六款PD
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1抗体药物。其中派姆单抗可用于所有实体瘤，而纳武单抗(Nivolumab，OPDIVO)可以单独或联合伊匹单抗(Ipilimumab,Yervoy)用于结直肠癌。
[0007]使用高通量测序技术对多个MSI位点同时进行检测和分析是一种常用的MSI状态分析方式。
[0008]对多个MSI位点同时进行检测时，不同的MSI位点组合所适用的MSI状态判定方式、灵敏度和准确性差异较大。如何去对目标MSI位点进行评估，并筛选合适的MSI位点还没有现成的系统性方法。
[0009]由此可见，研发一种系统性筛选MSI位点的方式对于肿瘤检测等医学检验领域具有重大意义。

技术实现思路

[0010]目前常用的MSI检测主要有以下三种方式：DNA错配修复检测(MMR检测)：直接对导致MSI现象的相关基因进行基因突变检测或免疫组化检测；PCR检测(MSI
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PCR)：使用特异的引物，对MONO
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27、NR27、NR
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24、NR
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21、BAT
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25和BAT
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26等位点进行逐一PCR或多重荧光PCR扩增并检测；NGS检测：使用高通量测序技术对多个MSI位点同时进行检测和分析。
[0011]然而专利技术人发现这三类技术中，对DNA错配修复基因的传统检验方法如Sanger测序或免疫组化，存在通量低，且成本高或操作复杂，且结果判定主观性强等缺点。而基于MSI
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PCR的方法，虽然可以直接评估微卫星位点的不稳定性，但同样存在操作复杂，灵敏度差等缺点。此外，MSI
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PCR或多重荧光PCR由于一次可以评估的位点有限，导致最后的结果梯度跨度太大。如1997年发布的Bethesda指导纲要中推荐了BAT
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25、BAT
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26、D2S123、D5S346和D17S250五个位点，检测结果呈20％、40％、60％、80％、100％这样的梯度，容易导致对于接近判定阈值的样本进行错误分类。而BAT
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25和BAT
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26在不同人种中的突变程度差异较大亦表明了这些位点在不同人群中具有偏好性。因而，采用NGS来对多个MSI位点同时进行检测成为一种拓展性强且可靠的选择。然而，采用NGS来对多个MSI位点同时进行检测时，不同的MSI位点组合所适用的MSI状态判定方式、灵敏度和准确性差异较大，如何去对目标MSI位点进行评估及筛选还没有现成系统性的方法。
[0012]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种筛选微卫星位点的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：1、对已知微卫星稳定性状态的样本进行测序，以便获得包含待分析微卫星位点的测序读段；2、基于所获得的测序读段，采用下列两种方式至少之一进行微卫星位点的筛选：a、将所述测序读段与参考序列进行比对，获得包含所述待分析微卫星位点的测序读段的读段数目及读段长度，获得目标微卫星位点；和b、基于包含待分析微卫星位点的测序读段在所述已知微卫星稳定性状态的样本中的step
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wise difference值，获得目标微卫星位点。根据本专利技术实施例的方法可以快速准确地筛选微卫星位点，所筛选的微卫星位点可以准确判断受试者的微卫星稳定性状态，进而区分受试者为微卫星高度不稳定型、微卫星低度不稳定型或微卫星稳定型。根据本专利技术实施例的方法，所筛选出的微卫星位点准确性及灵敏度高，适合利用高通量测序方法对受试者的微卫星稳定性状态进行判断，并且该方法适用于实体瘤患者微卫星位点的筛选，适用范围广泛，为肿瘤的诊断、治疗、科学研究、药物筛选等提供了帮助。例如，利用本专利技术的方法筛选微卫星位点及其对应样本的稳定性状态，进而研究相应物种的进化与发育，利用物种间微卫星位点的差异与微卫星稳定性状态对物种、组织的起源进行追踪。
[0013]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一组标记物，所述标记物用于检测微卫星不稳定性。根据本专利技术的实施例所述标记物是利用本专利技术第一方面所提出的方法获得的。根据本专利技术实施例的标记物可以选择性应用于靶向测序或全基因组测序等基因检测技术，从而对癌症等的治疗方案拟定及预后提供指导。
[0014]在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一组探针，所述探本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选微卫星位点的方法，其特征在于，包括：(1)对已知微卫星稳定性状态的样本进行测序，以便获得包含待分析微卫星位点的测序读段；(2)基于所获得的测序读段，采用下列两种方式至少之一进行微卫星位点的筛选：(a)将所述测序读段与参考序列进行比对，获得包含所述待分析微卫星位点的测序读段的读段数目及读段长度，获得目标微卫星位点；和(b)基于包含待分析微卫星位点的测序读段在所述已知微卫星稳定性状态的样本中的step
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wise difference值，获得目标微卫星位点。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本包括下列至少之一：微卫星稳定样本、微卫星不稳定样本；任选地，所述微卫星不稳定样本包括微卫星高不稳定样本和微卫星低不稳定样本。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方式(a)进一步包括：基于所获得的所述包含所述待分析微卫星位点的测序读段的读段数目及读段长度，得到所述读段长度的频率分布。4.根据权利要求2～3任一项所述的方法，其特征在于，进一步包括：当待测样本中包含待分析微卫星位点的不同测序读段长度的数目大于10个时，来源于微卫星不稳定样本的至少两个读段长度的频率是来源于微卫星稳定样本的读段长度的频率的至少一倍以上，是所述包含所述待分析微卫星位点的测序读段落入第一目标微卫星位点分析片段集的指示，以便获得第一目标微卫星位点；当待测样本中包含待分析微卫星位点的测序读段长度的数目不大于10个时，来源于微卫星不稳定样本的至少一个读段长度的频率是来源于微卫星稳定样本的读段长度的频率的至少一倍以上，是所述包含所述待分析微卫星位点的测序读段落入第二目标微卫星位点分析片段集的指示，以便获得第二目标微卫星位点。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包含待分析微卫星位点的测序读段包括：第一读段，所述第一读段包含所述微卫星位点以及上游序列及下游序列；任选地，所述读段数目为所述第一读段的数目；任选地，所述读段长度为所述第一读段的除去所述上游序列及下游序列的读段的长度。6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方式(b)进一步包括：除去所述微卫星稳定样本中step
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wise difference值标准差不小于0.1的位点；除去所述微卫星高不稳定样本中step
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wise difference值标准差不大于0.2的位点；和除去所述微卫星高不稳定样本中step
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wise difference值与所述微卫星稳定样本中step
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wise difference值相同的位点，以便获得第三目标微卫星位点分析片段集，进而获得第三目标微卫星位点。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：(I)利用所述待分析微卫星位点，获取待设计探针区域的序列；(II)将所述待设计探针区域的序列与参考基因组进行比对，以便获得所述待设计探针
区域的序列在所述参考基因组上对应区域的数目；和(III)选择在所述参考基因组上对应区域数目不大于10的位点，以便获得第四目标微卫星位点。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，进一步包括：将下列目标微卫星位点分析片段集的至少之一进行比对：所述第一目标微卫星位点、所述第二目标微卫星位点、所述第三目标微卫星位点和所述第四目标微卫星位点，获得共同的微卫星位点片段集，以便获得第五目标微卫星位点。9.一组标记物，所述标记物用于检测微卫星不稳定性，其特征在于，所述标记物是利用权利要求1～8任一项所述方法获得的。10.根据权利要求9所述的标记物，其特征在于，包括如表(1)所示的微卫星位点至少之一。11.一组探针，所述探针用于识别权利要求9或10所述的标记物，其特征在于，所述探针包括如SEQ ID NO:1～23所示的核苷酸序列至少之一。12.一种试剂盒，所述试剂盒用于检测微卫星不稳定性，其特征在于，所述试剂盒包括用于识别权利要求9或10所述的标记物的探针和/或用于扩增权利要求9或10所述的标记物的引物。13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如SEQ ID NO：1
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23所示序列至少之一的探针组。14.一种筛选微卫星位点的系统，其特征在于，包括：测序装置，对已知微卫星稳定性状态的样本进行测序，以便获得包含待分析微卫星位点的测序读段；筛选装置，所述筛选装置与所述测序装置相连，基于所获得的测序...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖姗姗，王涛，常壹照，
申请(专利权)人：杭州瑞普基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：