一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取和文库构建方法技术

本发明专利技术提供了一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取和文库构建方法，属于医学和生物技术领域。通过添加助沉试剂到尿液中实现外泌体有效沉降，解决RNA材料受限的问题，同时采用Trizol试剂直接对外泌体进行RNA提取且去除回溶、纯化步骤，减少RNA在提取中损失和降解，为后续建库提供合格原料。通过修复cDNA损伤，优化末端修复加A、纯化步骤，以及文库扩增反应循环数，使用高保真酶预混液进行PCR扩增进行建库，该文库保存了外泌体分子多样性，为NGS技术在液体活检和诊断的应用提供可靠样本。该方法有效解决了尿液样本外泌体含量低，提取RNA总量低，无法有效建库，利用NGS平台测序的难题。利用NGS平台测序的难题。利用NGS平台测序的难题。

【技术实现步骤摘要】
一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取和文库构建方法


[0001]本专利技术属于医学和生物
，具体涉及一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取和文库构建方法。

技术介绍

[0002]外泌体(Exosomes)，或称细胞外囊泡(EV)，是数种起源与功能不同的，具有双层膜结构，直径为30nm～200nm的囊泡结构。其功能有参与细胞之间的信息传递与物质交换、对宿主
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病原体相互关系的调节、炎症反应的介导等。外泌体的成分包括DNA、RNA、糖类、脂类与蛋白质等，由于其参与多种生理与病理过程，其成分可以作为对多种传染性疾病与肿瘤诊断的生物标志物。利用外泌体来源的生物标志物进行诊断，已经成为现代医学最受关注的新领域。通过NGS技术对外泌体来源的核酸进行测序，是这一领域目前最广泛使用的手段。
[0003]尿液作为一种人类体液，在液体活检和生物医学诊断中具有其独特优势
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方便获得与收集，且收集过程对受检者无伤害，这一特征是血液、恶性积液、穿刺组织等无可比拟的。当前，尿液外泌体技术具有广泛应用前景，而对其应用研究较为缺乏。
[0004]分离、提取人类体液样本RNA并建立合格的文库已成为当前外泌体研究领域亟待解决的问题。外泌体研究的第一步是外泌体的分离。外泌体作为生物医学诊断中液体活检的重要的生物标志物来源和生物医学治疗的重要给药手段，受到临床研究者的广泛关注。但由于多种因素影响，临床上采用各种人类体液作为外泌体检测来源时均存在分离技术问题，如血浆和血清含有大量非EV脂质结构(低/极低/高密度脂蛋白)，乳汁充满含脂肪的液泡，尿液含有尿调节素(Tamm
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Horsfall蛋白)，支气管肺泡灌洗液含表面活性剂。在外泌体分离后，对外泌体RNA的提取和文库构建同样是使用NGS技术进行诊断的难点。
[0005]由于外泌体在体液中存在的浓度很低，同时部分Tamm
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Horsfall蛋白一同聚沉造成肉眼下外泌体沉淀假阳性，且影响提取效率，提取外泌体RNA需要稳定的试剂和标准流程，现有的提取方法非常复杂，对人员和仪器设备均有很高要求且耗时，同时RNA提取过程中多次纯化造成RNA损失及多样性降低，这一技术限制了外泌体在临床上的利用。常规RNA提取方法则由于繁琐的冷冻、回溶操作，同样对人员和设备有很高要求，且RNA在提取中损失很大，对RNA含量较低的样本有很大局限。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种改进的用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，该方法有效解决了低RNA含量样本，提取的RNA质量差、总量低，无法有效建库的问题。
[0007]本专利技术的目的还在于提供一种改进的用于NGS平台的尿液外泌体RNA文库构建方法，构建的外泌体RNA文库满足测序要求，克服了尿液外泌体难以利用NGS平台测序的难题。
[0008]本专利技术提供了一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，包括以下步骤：
[0009]1)尿液样本去除细胞或细胞碎片后，与助沉试剂混合，分离外泌体；
[0010]2)用Trizol试剂与所述外泌体混合，静置，得到混合液；
[0011]3)将所述混合液和溴氯丙烷混合，静置，收集水相，依次经异丙醇和体积浓度75％的乙醇水溶液纯化，离心收集上清液得到外泌体RNA。
[0012]优选的，所述助沉试剂包括PEG 8000分离液。
[0013]优选的，所述PEG 8000分离液为300～600g/L PEG8000和0.5～2.5M NaCl的水溶液。
[0014]优选的，尿液样本与助沉试剂的体积比为2：0.5～1.5。
[0015]优选的，Trizol试剂的体积和外泌体的质量比为1mL：5～30mg。
[0016]优选的，所述混合液和溴氯丙烷的体积比为1：0.2～0.3。
[0017]本专利技术提供了一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA建库方法，包括以下步骤：
[0018]A.A.将外泌体的RNA进行片段化处理后，依次经逆转录、纯化，得到cDNA；
[0019]B.将所述cDNA进行末端修复加A反应，连接接头，纯化；
[0020]C.将步骤B得到的纯化产物进行片段分选，得到分选DNA片段；
[0021]D.将所述分选DNA片段进行文库扩增，纯化，得到外泌体RNA文库。
[0022]优选的，步骤A中所述外泌体的RNA为采用所述方法提取得到的外泌体RNA。
[0023]优选的，步骤A中所述片段化处理的条件为在70～100℃下进行金属离子处理片段化处理5～20min。
[0024]优选的，步骤D中所述扩增的反应程序：98℃30sec；98℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，13个循环；72℃5min；
[0025]步骤D中所述扩增的反应体系为50μL，其中分选DNA片段20μL，PCR引物混合物5μL，扩增反应缓冲液25μL。
[0026]本专利技术提供的用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，以尿液样本制备的外泌体作为检测对象，采用适当的助沉试剂分离外泌体，不仅能有效从样本中沉降出外泌体，而且不会引起假阳性，具有经济实用，操作方便快捷的忒点，得到大量外泌体为提取RNA提供材料基础；同时，本专利技术加入Trizol直接抽提RNA，缩短实验流程且去除多余回溶、纯化步骤，减少了RNA在提取过程中的损失。因此，本专利技术提供的外泌体RNA提取方法，不仅获得理想浓度的RNA，而且提取过程操作简便，成本低，适合在NGS检测中临床应用。
[0027]同时本专利技术提供的外泌体RNA提取方法，是以尿液为检测对象，不仅降低提取成本而且取样方面，降低了临床检测给患者带来痛苦，易于临床推广应用。
[0028]本专利技术提供的用于NGS平台的尿液外泌体RNA建库方法，包括先对RNA片段化，再进行逆转录扩增cDNA和纯化，再进行末端修复和纯化、接头连接和纯化、双筛、prePCR和纯化等步骤。本申请针对常规NGS建库方法中涉及纯化的繁琐操作而提出的，常规方法不仅损失大量核酸，而且分子多样性受不可避免的不利影响，本专利技术通过优化建库流程，调整了操作顺序，省略了部分纯化的步骤，提出了针对微量尿液外泌体RNA样本的cDNA的NGS文库构建方法，该方法构建的NGS文库不仅满足NGS的测序要求，而且操作简便，为针对外泌体的靶向用药提供关键的临床诊断靶标突变位点信息，为患者制定个体化的治疗方案，提高患者生活质量，延长患者的生存时间提供了保障。
附图说明
[0029]图1为本专利技术提供的外泌体分离的图片。
具体实施方式
[0030]本专利技术提供了一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，包括以下步骤：
[0031]1)尿液样本去除细胞或细胞碎片后，与助沉试剂混合，分离外泌体；
[0032]2)用Trizol试剂与所述外泌体混合，静置，得到混合液；
[0033]3)将所述混合液和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1)尿液样本去除细胞或细胞碎片后，与助沉试剂混合，分离外泌体；2)用Trizol试剂与所述外泌体混合，静置，得到混合液；3)将所述混合液和溴氯丙烷混合，静置，收集水相，依次经异丙醇和体积浓度75％的乙醇水溶液纯化，离心收集上清液得到外泌体RNA。2.根据权利要求1所述用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，其特征在于，所述助沉试剂包括PEG 8000分离液。3.根据权利要求2所述用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，其特征在于，所述PEG 8000分离液为300～600g/L PEG 8000和0.5～2.5M NaCl的水溶液。4.根据权利要求1所述用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，其特征在于，尿液样本与助沉试剂的体积比为2：0.5～1.5。5.根据权利要求1所述用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，其特征在于，Trizol试剂的体积和外泌体的质量比为1mL：5～30mg。6.根据权利要求1～5任意一项所述用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，其特征在于，所述混合液和溴氯丙烷的体积比为1：(0.2～...

【专利技术属性】
技术研发人员：许明炎，张晓妮，李慧，林郁松，
申请(专利权)人：深圳海普洛斯医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：