用于CKO载体构建的引物组制造技术

本发明专利技术提供了用于CKO载体构建的引物组，其包含Seq ID No.1:5

【技术实现步骤摘要】
用于CKO载体构建的引物组


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，本专利技术涉及高通量构建CKO载体的方法。

技术介绍

[0002]基因修饰的模型动物在现在医学研究中必不可少，尤其今年新冠疫情的爆发，将基因编辑推到历史高峰。基因编辑技术也在不断更新，从传统的ES打靶技术到核酸酶技术，而核酸酶技术历经锌指核酸酶(ZFN)
‑
转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)
‑
CRISPR/Cas系统三代技术革新后，CRISPR/Cas9核酸酶技术在2020年荣获诺贝尔化学奖，如今在科研界更是一枝独秀。
[0003]常规的基因编辑技术有转基因(Transgenic gene)、基因敲除(Knock
‑
out)、基因敲入(Knock
‑
in)、RNA干扰(RNAi)。其中基因敲除技术是功能基因组学研究的重要工具，但是传统的基因敲除模型在胚胎致死基因的研究方便有一定局限性，条件性基因敲除(Conditional Knock
‑
out，简写为CKO)在克服传统基因敲除缺陷的情况下，其能实现时间和空间调控基因删除的优势使得在研究领域颇受欢迎。条件性基因敲除是通过染色体位点特异性重组酶系统来实现的，常用的重组酶系统Cre
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LoxP或Flp
‑
Frt，近年Cre家族位点Dre
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Rox也应用很多，其中Cre重组酶是最经典的工具，其最佳反应温度是37℃，因此在细胞或动物体内重组反应效率最高，使用也最广。基因敲除把两个LoxP位点放到目的基因一个或几个重要的外显子两端，制备出Flox小鼠，该目的基因表达不受LoxP插入的影响，而当该Flox小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，Cre酶的组织特异性表达可以促进目的基因两侧的LoxP位点发生重组，目的基因完整性被破坏，从而发生基因功能缺失，而该基因在其他组织或细胞表达正常。
[0004]CRISPR/Cas9编辑技术以其高效、操作简便、成本低等特点被广泛应用于基因敲除小鼠实验中，条件性基因敲除模型的制备流程：sgRNA位点确定
‑
CKO载体构建
‑
受精卵显微注射
‑
F0嵌合体小鼠
‑
具有生殖遗传的F1小鼠
‑
F1小鼠与组织特异性工具鼠Cre交配获得条件性敲除的Fn小鼠。其中载体设计尤为重要，需要在KO区域的两端引入LoxP位点，常见的方法是在载体骨架上引入该位点，然后再将5
’
arm、CKO region、3
’
arm分别构建到骨架上，该方法非常耗时，载体构建周期需要6～8周。
[0005]另一种方法是将loxP位点在扩增引物的5
’
引入，因此扩增好的5
’
arm、CKO region、3
’
arm可以一次性构建至骨架中，将周期缩短至2～3周但是该方法由于要引入LoxP位点和Overlapping序列，因此要合成超长的引物，目前的合成公司大于80bp的引物产量就非常低，而且突变或缺失的比例很高，每次合成的质量都有差异，价格和周期都相应增长。因此研发出一套高通量构建CKO载体的方法尤其重要。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的第一问题在于克服现有技术构建CKO载体，突变或缺失率较高的问题，提供了两条通用序列作为引物，能获得较高正确率以用于CKO载体构建。
[0007]为了解决现有技术中的这些问题，在第一个方面，本专利技术提供的技术方案是：用于CKO载体构建的引物组，包括Seq ID No.1:5
’‑
ACGTAAACGGCCACAAGTTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCACATGAAGCAGCACGACT
‑3’
，(74bp)划线区域为LoxP序列；
[0008]Seq ID No.2:5
’‑
GTGGATTCGGACCAGTCTGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
‑3’
，(74bp)划线区域为LoxP序列。
[0009]优选地，所述引物组还包括：
[0010]5’
arm下游引物Seq ID No.3：5
’‑
GAACTTGTGGCCGTTTACGTGCTAGCAATTN1…
Nx
‑3’
，3
’
arm上游引物Seq ID No.4：5
’‑
TCAGACTGGTCCGAATCCACGAGCTCAATATTN1…
Nx
‑3’
,CKO
‑
1上游引物Seq ID No.5：5
’‑
TAGCATGAAGCAGCACGACTN1…
Nx
‑3’
CKO
‑
1下游引物Seq ID No.6：5
’‑
TAGTTGCCGTCGTCCTTGAAN1…
Nx
‑3’
,所述N选自ATCG四种碱基中的一种，且x≤30，优选x≤25。上述的引物中，每条引物的一部分是固定序列，另外一部分N1…
Nx则是根据具体打靶基因位点的序列进行设计。
[0011]优选地，所述引物组还包括：5
’
arm上游引物，3
’
arm下游引物，其是根据具体打靶基因位点的序列进行设计。
[0012]本专利技术的一实施例中，所述引物组还包括：5
’
arm下游扩增序列Seq ID No.7：5
’‑
GAACTTGTGGCCGTTTACGTGCTAGCAATTGGGTCCAACTCGCTCCAAAGCTCAC
‑3’
，3
’
arm上游扩增序列Seq ID No.8：5
’‑
TCAGACTGGTCCGAATCCACGAGCTCAATATTGGATGGCCATCCAAAGATGGTG
‑3’
，CKO
‑
1扩增序列Seq ID No.9：5
’‑
TAGCATGAAGCAGCACGACTTGGGAAAACTCCTATGGGAGATGAG
‑3’
，CKO
‑
1扩增序列Seq ID No.10：5
’‑
TAGTTGCCGTCGTCCTTGAATCCTGGTTAAGAACAACTTCTGCAT
‑3’
。
[0013]本专利技术第二方面，还提供用于CKO载体构建的试剂盒，所述试剂盒中包含如下引物：Seq ID No.1:5
’‑
ACGTAAACGGCCACAAGTTCATAACTTCGT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于CKO载体构建的引物组，其特征在于，所述引物组包括Seq ID No.1:5
’‑
ACGTAAACGGCCACAAGTTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCACATGAAGCAGCACGACT
‑3’
；Seq ID No.2:5
’‑
GTGGATTCGGACCAGTCTGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
‑3’
。2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，还包括：5
’
arm下游引物Seq ID No.3：5
’‑
GAACTTGTGGCCGTTTACGTGCTAGCAATTN1…
Nx
‑3’
，3
’
arm上游引物Seq ID No.4：5
’‑
TCAGACTGGTCCGAATCCACGAGCTCAATATTN1…
Nx
‑3’
,CKO
‑
1上游引物Seq ID No.5：5
’‑
TAGCATGAAGCAGCACGACTN1…
Nx
‑3’
CKO
‑
1下游引物Seq ID No.6：5
’‑
TAGTTGCCGTCGTCCTTGAAN1…
Nx
‑3’
,所述N选自ATCG四种碱基中的一种，且x≤30。3.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，所述引物组还包括：5
’
arm上游引物，3
’
arm下游引物。4.用于CKO载体构建的试剂盒，所述试剂盒中包含如下引物：Seq ID No.1:5
’‑
ACGTAAACGGCCACAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏翠，
申请(专利权)人：赛业苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：