本发明专利技术公开了一种吗啡啉在控制裂殖壶菌发酵过程中不皂化物含量、提高DHA油脂的含量中的应用，本发明专利技术通过在裂殖壶菌发酵过程中外源添加吗啡啉来降低裂殖壶菌发酵过程中甾醇含量且提高油脂含量，并通过裂殖壶菌的细胞生长的生物量、油脂产量以及不皂化物含量指标来确定吗啡啉的最佳添加浓度，与未添加相比，添加1.8g/L的吗啡啉的甾醇含量降低了64.86％，油脂产量提高了67.51％，DHA含量提高了25.5％，虾青素含量提高了85％，显著提高了裂殖壶菌产DHA油脂和虾青素的含量。本发明专利技术首次将吗啡啉应用到裂殖壶菌不皂化物含量的调控中，为提高裂殖壶菌中油脂的含量提供了新的思路，在工业化生产方面存在巨大的潜力。在工业化生产方面存在巨大的潜力。
【技术实现步骤摘要】
吗啡啉在控制裂殖壶菌发酵过程中不皂化物含量、提高DHA油脂的含量中的应用
[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及吗啡啉在控制裂殖壶菌发酵过程中不皂化物含量、提高DHA油脂的含量、虾青素含量中的应用及其具体方法。
技术介绍
[0002]二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是一种重要的ω
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3系列多不饱和脂肪酸，对人体健康具有诸多重要的生理功效。传统的DHA生产原料主要来源于深海鱼油，但是鱼油资源的日益减少、鱼油特有的腥味、氧化稳定性差、易受海洋化学污染和高处理成本等缺点都造成了油含量和油中不饱和脂肪酸含量的不稳定性，且产量较低。因此，寻找一种新的DHA来源已经成为单细胞油脂的研究焦点。
[0003]根据藻油DHA的国标(GB 26400
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2011)要求，要求裂殖壶菌生产的DHA油脂中的不皂化物含量低于4％(w/w)。工业生产中，去除油脂中的不皂化物主要依靠繁杂的油脂提取精制过程，控制不皂化物含量低于4％造成了油脂后加工过程成本大幅度增加，并且对油脂品质造成了不良影响。不皂化物主要是微生物在代谢过程中生产的角鲨烯和甾醇积累造成的。
[0004]通过外源添加化合物提高油脂产量的方式已经广泛应用于裂殖壶菌发酵生产过程中，主要集中在以下几个方面：申请号201710548502.1的专利公开了在裂殖壶菌的发酵培养基中一次添加终浓度为100mg/L～3g/L的苯甲酸对位衍生物，添加的时机为发酵培养开始至发酵培养结束前1～2d中的任意时间，相较于原始培养基，油脂产量提高了32.12％；申请号为201010504635.7的专利公开了向可产DHA的微生物培养基中添加乙酸、柠檬酸和辛伐他汀中的任意一种或几种组合的方法，可使微生物体内的DHA含量可有效得到提高；申请号为201010237946.1的专利在发酵培养基中添加甘氨酸甜菜碱或者海藻糖可以提高裂殖壶菌的多不饱和脂肪酸的含量；在裂殖壶菌传统优化培养基的基础上添加外源物有以下几种如：芝麻素(Lipids，1991，26(7)：512
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516)、姜黄素(Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2000，64(8)：1641
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5)以及辣椒素(Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2001，65(8)：1859
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1863)，这类物质在代谢过程中可以抑制油脂的去饱和。目前，通过外源添加吗啡啉来控制裂殖壶菌菌种的甾醇和油脂含量未见报道。
技术实现思路
[0005]专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种吗啡啉在控制裂殖壶菌发酵过程中不皂化物含量、提高油脂的含量中的应用，本专利技术提供一种提高裂殖壶菌产DHA油脂以及虾青素且降低甾醇含量的发酵调控外源添加因子
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吗啡啉，该化合物首次被应用到调控裂殖壶菌甾醇含量中，且调节效果显著。本专利技术在裂殖壶菌的发酵过程中根据细胞生长情况和DHA油脂产量来确定加入吗啡啉的最佳浓度，降低了生产成本，节省人力物力，提高了生产效率。
[0006]技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述吗啡啉在控制裂殖壶菌发酵过程中不皂化物含量、提高DHA油脂的含量中的应用。
[0007]其中，所述裂殖壶菌在发酵过程中添加外源物质吗啡啉。
[0008]其中，所述裂殖壶菌在发酵过程中添加外源物质吗啡啉可显著降低不皂化物含量，尤其是甾醇的含量，同时提高DHA油脂和虾青素的含量。
[0009]本专利技术所述通过添加外源因子吗啡啉来控制裂殖壶菌发酵过程中不皂化物含量以及提高DHA油脂、虾青素含量的方法，包括如下步骤：
[0010](1)将低温冻存的裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液；
[0011](2)将裂殖壶菌的种子液接入发酵培养基进行培养，发酵12
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14h时，向发酵培养基中加入所述外源物质吗啡啉，继续发酵至发酵结束测定产物。
[0012]作为优选，所述发酵培养基中所添加的吗啡啉的浓度为1.0
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2.5g/L。进一步地，吗啡啉浓度1.7g/L
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2.1g/L。
[0013]其中，所述种子培养基的pH为6～8，配方为：葡萄糖30.0g/L、酵母抽提物10.0g/L、硫酸钠12.0g/L、二水合氯化钙0.17g/L、氯化钾0.50g/L、硫酸镁2.0g/L、硫酸钾0.65g/L、磷酸二氢钾1.0g/L。
[0014]其中，所述发酵培养基的pH为6～8，配方为：葡萄糖80.0g/L、谷氨酸钠5.0g/L、酵母粉5.0g/L、硫酸钠12.0g/L、氯化钾0.50g/L、硫酸镁2.0g/L、硫酸钾0.65g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、二水合氯化钙0.17g/L、硫酸铵1.0g/L。
[0015]本专利技术所述的通过添加外源因子吗啡啉来控制裂殖壶菌发酵过程中不皂化物含量以及提高DHA油脂和虾青素含量的方法在裂殖壶菌高效生产油脂工业化中的应用。
[0016]本专利技术提出了调控裂殖壶菌甾醇及油脂合成的调控因子，所述的调控因子是吗啡啉。同时提出了一种调控裂殖壶菌甾醇及油脂合成的调控方法，通过测试细胞的生长情况和产DHA油脂和虾青素的含量来确定加入吗啡啉的最佳添加浓度，将最优添加浓度的吗啡啉加入到裂殖壶菌发酵培养基中进行充分发酵。
[0017]作为优选，本专利技术的发酵方法中，具体的实验步骤如下：
[0018]1、将保存在甘油管中的裂殖壶菌接入20mL的种子培养基中，接种量为体积比1％，于28℃的温度及180rpm的转速下，培养24h，获得一级种子；
[0019]2、将上述一级种子接入20mL的种子培养基中，接种量为体积比3％，于28℃的温度及180rpm的转速下，培养24h，获得二级种子；
[0020]3、将二级种子接入100mL的发酵培养基中，接种量为体积比1％，于30℃的温度及180rpm的转速下，培养48h，在此期间，在发酵12h时，在发酵培养基中加入不同浓度的吗啡啉，浓度依次为1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、1.6g/L、1.7g/L、1.8g/L、1.9g/L、2.0g/L、2.1g/L、2.2g/L、2.3g/L、2.4g/L、2.5g/L。分别测试加入不同浓度的吗啡啉的细胞生长情况和油脂产量。
[0021]4、发酵结束后，油脂等物质的提取按照以下步骤：
[0022](1)准确吸取适量发酵液于1具塞试管中，调节pH为10～12，混匀后再加入发酵液体积比0.5％的破壁酶，于50℃酶解90min至菌体消化完全；
[0023](2)按照和发酵液体积比1:1的比例加入无水乙醇，使蛋白沉淀下来；
[0024](3)再加入适量正己烷，加塞充分摇匀，静置分层，取上层有机相置于已恒重的磨
口锥形瓶中，用正己烷重复洗涤2～3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.吗啡啉在控制裂殖壶菌发酵过程中不皂化物含量、提高DHA油脂的含量中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述裂殖壶菌在发酵过程中添加外源物质吗啡啉。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述裂殖壶菌在发酵过程中添加外源物质吗啡啉可显著降低不皂化物含量，尤其是甾醇的含量，同时提高DHA油脂和虾青素的含量。4.一种通过添加外源因子吗啡啉来控制裂殖壶菌发酵过程中不皂化物含量以及提高DHA油脂、虾青素含量的方法，其特征在在于，包括如下步骤：(1)将低温冻存的裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液；(2)将裂殖壶菌的种子液接入发酵培养基进行培养，发酵12
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14h时，向发酵培养基中加入所述外源物质吗啡啉，继续发酵至发酵结束测定产物。5.根据权利要求4所述的通过添加外源因子吗啡啉来控制裂殖壶菌发酵过程中不皂化物含量以及提高DHA油脂、虾青素含量的方法，其特征在于，所述发酵培养基中所添加的吗啡啉的浓度为1.0g/L
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2.5g/L。6.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，杜菲，孙小曼，许莹霜，王伶如，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：
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