一种干扰素的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种干扰素的制备方法，包括以下步骤：步骤1、分离灰黄层、步骤2、氯化铵处理、步骤3、起动诱生、步骤4、正式诱生、步骤5、收获、步骤6、纯化。该一种干扰素的制备方法一次制备量大，回收率高于60％，经济，简便，易于普及，效价，比活2.2

【技术实现步骤摘要】
一种干扰素的制备方法


[0001]本专利技术涉及干扰素生产
，尤其涉及一种干扰素的制备方法。

技术介绍

[0002]干扰素是一类糖蛋白，它具有高度的种属特异性，故动物的干扰素对人无效，干扰素具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫及抗肿瘤作用。
[0003]干扰素主要用于治疗晚期毛细胞白血病、肾癌、黑色素瘤、Kaposi肉瘤、慢性粒细胞性白血病和中低度恶性非霍奇金淋巴瘤，其他曾用于骨肉瘤、乳腺癌、多发性骨髓瘤、头颈部癌和膀胱癌等，也适用于急、慢性丙型病毒性肝炎，慢性活动性乙型肝炎。
[0004]现有的干扰素的制备方法一次性制备的量较小，为此，我们提出了一种干扰素的制备方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种干扰素的制备方法，解决了上述问题。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]本专利技术提供一种干扰素的制备方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1、分离灰黄层：将100ml血液采入含有抗凝剂的塑料袋内，离心后分离出血浆吸取灰黄层，将吸取的灰黄层，放置4℃冰箱中8
‑
12小时；
[0009]步骤2、氯化铵处理：每份灰黄层加入30ml缓冲盐水，再加入总体积9倍量的冷的0.83％的氯化铵溶液，混匀，40℃放置10min，然后在4℃离心(8，000转/min)20min，弃去溶血上清液，并加入适量的缓冲盐水，收集沉淀的细胞，作成悬液，再用9倍量的0.83％氯化铵液重复处理一次，溶解残存的红细胞，取沉淀的白细胞并悬于培养液中，置于冰浴，取样作活细胞计数，用预温的培养液稀释成每毫升含107个活细胞；
[0010]步骤3、起动诱生：取稀释的细胞悬液加入白细胞干扰素，使其最后浓度为100u/ml，置37℃水浴搅拌培养2h；
[0011]步骤4、正式诱生：起动后的白细胞加入仙台病毒，使其最后浓度为100
‑
150血凝单位/ml，在37℃搅拌培养8
‑
12小时；
[0012]步骤5、收获：将培养物离心(2，500r/min)30min，吸取上清液即得粗制干扰素，取样作无菌试验并测定效价，每份灰黄层约能制备100万单位的纯化干扰素；
[0013]步骤6、纯化：将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾到0.5molL，用2molL盐酸调节pH3
‑
53.5，离心弃去上清液，沉淀A加入原体积1/5量的90
‑
96％冷乙醇，离心弃沉淀，上清液A用盐酸调节pH至5.5，离心弃去沉淀，再调至pH5.8，离心，得上清液B和沉淀B，沉淀B加入原体积1/50量的甘氨酸
‑
盐酸缓冲液溶解，检测，得干扰素。
[0014]优选的，步骤1中所述抗凝剂为枸橼酸钠、肝素、乙二胺四乙酸的一种，400ml血液吸取13
‑
15ml,约为血中细胞的40
‑
50％。
[0015]优选的，步骤6中上清液B中加盐酸使pH值降至3,离心,得到沉淀物C,在沉淀物C中
加原体积1/5,500量的pH8、0.1mol/L PBS溶解,加NaOH调节pH7
‑
7.5，对PBS透析，静置12小时，离心，收集上清液，检测，得PIEN
‑
A。
[0016]优选的，步骤6中上清液B调节pH至8，离心弃去清液，得到沉淀物D，在沉淀物D中加原体积1/50量的0.1mol/LPBSO.5mol/L硫氰化钾溶解，pH降至5.2，离心得上清液C和沉淀物E，沉淀物E加原体积1/2，500量的pH8、0.1molL PBS溶解,调至pH7
‑
7.5，对PBS透析，静置12小时，离心，收集上清液，检测，得PIFN
‑
B。
[0017]优选的，步骤2中培养液的基础成分为Eagle
’
s培养基，其中含4
‑
6％的人血浆蛋白，无磷酸盐，合Tricine 3mg/ml及适量抗生素。
[0018]优选的，步骤4中的仙台病毒在10天龄鸡胚中培养48
‑
72h，收获尿囊液获得。
[0019]优选的，步骤5中作效价测定的材料在pH2的条件下处理24h后进行检定。
[0020]优选的，步骤6中的pH调节剂为盐酸。
[0021]优选的，步骤6中甘氨酸
‑
盐酸缓冲液的pH为2。
[0022]本专利技术的有益效果：本专利技术一次制备量大，回收率高于60％，经济，简便，易于普及，效价，比活2.2
×
10
°
u/mg蛋白，PIFN
‑
A中干扰素含量占回收干扰素的82％，比活也比较高，IIFN的比活较低(5
×
10'u/mg蛋白)。
具体实施方式
[0023]下面结合实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。
[0024]步骤1、分离灰黄层：将100ml血液采入含有抗凝剂的塑料袋内，离心后分离出血浆吸取灰黄层，将吸取的灰黄层，放置4℃冰箱中8小时；
[0025]步骤2、氯化铵处理：每份灰黄层加入30ml缓冲盐水，再加入总体积9倍量的冷的0.83％的氯化铵溶液，混匀，40℃放置10min，然后在4℃离心(8，000转/min)20min，弃去溶血上清液，并加入适量的缓冲盐水，收集沉淀的细胞，作成悬液，再用9倍量的0.83％氯化铵液重复处理一次，溶解残存的红细胞，取沉淀的白细胞并悬于培养液中，置于冰浴，取样作活细胞计数，用预温的培养液稀释成每毫升含107个活细胞；
[0026]步骤3、起动诱生：取稀释的细胞悬液加入白细胞干扰素，使其最后浓度为100u/ml，置37℃水浴搅拌培养2h；
[0027]步骤4、正式诱生：起动后的白细胞加入仙台病毒，使其最后浓度为100
‑
150血凝单位/ml，在37℃搅拌培养10小时；
[0028]步骤5、收获：将培养物离心(2，500r/min)30min，吸取上清液即得粗制干扰素，取样作无菌试验并测定效价，每份灰黄层约能制备100万单位的纯化干扰素；
[0029]步骤6、纯化：将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾到0.5molL，用2molL盐酸调节pH3
‑
53.5，离心弃去上清液，沉淀A加入原体积1/5量的90
‑
96％冷乙醇，离心弃沉淀，上清液A用盐酸调节pH至5.5，离心弃去沉淀，再调至pH5.8，离心，得上清液B和沉淀B，沉淀B加入原体积1/50量的甘氨酸
‑
盐酸缓冲液溶解，检测，得干扰素。
[0030]步骤6中上清液B中加盐酸使pH值降至3,离心,得到沉淀物C,在沉淀物C中加原体积1/5,500量的pH8、0.1mol/L PBS溶解,加NaOH调节pH7...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干扰素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1、分离灰黄层：将100ml血液采入含有抗凝剂的塑料袋内，离心后分离出血浆吸取灰黄层，将吸取的灰黄层，放置4℃冰箱中8
‑
12小时；步骤2、氯化铵处理：每份灰黄层加入30ml缓冲盐水，再加入总体积9倍量的冷的0.83％的氯化铵溶液，混匀，40℃放置10min，然后在4℃离心(8，000转/min)20min，弃去溶血上清液，并加入适量的缓冲盐水，收集沉淀的细胞，作成悬液，再用9倍量的0.83％氯化铵液重复处理一次，溶解残存的红细胞，取沉淀的白细胞并悬于培养液中，置于冰浴，取样作活细胞计数，用预温的培养液稀释成每毫升含107个活细胞；步骤3、起动诱生：取稀释的细胞悬液加入白细胞干扰素，使其最后浓度为100u/ml，置37℃水浴搅拌培养2h；步骤4、正式诱生：起动后的白细胞加入仙台病毒，使其最后浓度为100
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150血凝单位/ml，在37℃搅拌培养8
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12小时；步骤5、收获：将培养物离心(2，500r/min)30min，吸取上清液即得粗制干扰素，取样作无菌试验并测定效价，每份灰黄层约能制备100万单位的纯化干扰素；步骤6、纯化：将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾到0.5molL，用2molL盐酸调节pH3
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53.5，离心弃去上清液，沉淀A加入原体积1/5量的90
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96％冷乙醇，离心弃沉淀，上清液A用盐酸调节pH至5.5，离心弃去沉淀，再调至pH5.8，离心，得上清液B和沉淀B，沉淀B加入原体积1/50量的甘氨酸
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盐酸缓冲液溶解，检测，得干扰素。2.根据权利要求1所述的一种干扰素的制备方法，其特征在于：步骤1中所述抗凝剂为枸橼酸钠、肝素、乙二胺四乙酸的一种，400ml血液吸取13
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【专利技术属性】
技术研发人员：李冬冬，訾红彦，
申请(专利权)人：南京英瀚斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：