包括非标准氨基酸的组合物及其用途制造技术

本文中提供了包含非标准氨基酸的稳定化的DNase I多肽，其即使在苛刻条件、例如还原环境下也保持酶活性。所述稳定化的DNase I多肽在还原环境中具有酶活性，所述酶活性高于在相同条件下没有非标准氨基酸的相应DNase I多肽。本文中还提供了编码所述稳定化的DNase I多肽的多核苷酸、用于表达和/或产生所述稳定化的DNase I多肽的细胞，以及使用所述稳定化的DNase I多肽的方法。I多肽的方法。I多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包括非标准氨基酸的组合物及其用途
交叉引用
[0001]本申请要求2018年7月9日提交的美国临时专利申请62/695,505号的权益，所述美国临时专利申请通过援引而整体地并入本文中。

技术介绍

[0002]许多酶的活性取决于它们催化其各自反应所处的环境，例如，具有还原条件的缓冲液。通常，酶依赖于某些结构特征以维持它们的活性，并且这些结构特征可能受损于某些条件。例如，在还原条件下，酶的分子间和/或分子内二硫键可以被还原，导致酶的结构改变，最终降低或失去活性。例如，用于单细胞测序和单细胞PCR的许多方法需要使用苛刻的裂解缓冲液来裂解液滴内的细胞以便提取或扩增多核苷酸(例如mRNA)或者从单细胞提取蛋白质。在裂解之后，通常采用反应，该反应包括反转录反应、聚合酶催化反应例如复制和/或合成多核苷酸、连接反应、扩增反应、核酸酶催化反应，以及蛋白酶介导反应。但是，由于催化这些反应的酶所处于的裂解缓冲液的苛刻性质，故此这些反应的催化剂通常被减弱或不可能。

技术实现思路

[0003]本文中提供了克服这些问题的组合物和方法。本文中提供了稳定化的酶，其即使在苛刻条件、例如还原环境中也保持活性。本文中提供了包括非标准氨基酸的稳定化的酶，其在苛刻条件、例如还原缓冲液中具有酶活性，其酶活性高于在相同条件下没有非标准氨基酸的相应酶。本文中还提供了编码这些稳定化的酶的多核苷酸、用于表达和/或产生这些稳定化的酶的细胞，以及使用这些稳定化的酶的方法。在一些方面中，稳定化的酶包括稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽。
[0004]在一些方面中，本文中提供了一种组合物，所述组合物包括稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽、其功能片段或其变异体，所述稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽包括一种或多种非标准氨基酸。
[0005]在一些方面中，本文中提供了一种组合物，所述组合物包括稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽、其功能片段或其变异体，所述稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽包括一种或多种非标准氨基酸，其中所述稳定化的DNase I多肽在环境中对DNA底物的内切核酸酶活性高于不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体对所述DNA底物的内切核酸酶活性。
[0006]在一些方面中，本文中提供一种组合物，所述组合物包括稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽、其功能片段或其变异体，所述稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽包括一种或多种非标准氨基酸，其中在不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体不稳定化的环境中，所述稳定化的DNase I多肽没有不稳定化。
[0007]在一些方面中，本文中提供一种组合物，所述组合物包括稳定化的脱氧核糖核酸
酶I(DNase I)多肽、其功能片段，或其变异体，所述稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽包括一种或多种非标准氨基酸，其中所述稳定化的DNase I多肽的解链温度(melting temperature，Tm)比不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体的T
m
高至少5℃。
[0008]在一些实施方案中，所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体的解链温度(Tm)比不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应重组酶、其功能片段或其变异体的T
m
高至少5℃。
[0009]在一些实施方案中，所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体在环境中对DNA底物的内切核酸酶活性高于不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体对所述DNA底物的内切核酸酶活性。
[0010]在一些实施方案中，在不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体不稳定化的环境中，所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体没有不稳定化。
[0011]在一些实施方案中，所述一种或多种非标准氨基酸中的至少一个、两个、三个、四个或更多个是硒代半胱氨酸(selenocysteine)。
[0012]在一些实施方案中，所述一种或多种非标准氨基酸中的至少两个由键直接连接。
[0013]在一些实施方案中，所述一种或多种非标准氨基酸中的至少四个由键直接连接，其中所述一种或多种非标准氨基酸中的所述至少四个中的第一对由键直接连接，并且所述一种或多种非标准氨基酸中的所述至少四个中的第二对由键直接连接。
[0014]在一些实施方案中，所述键是二硒键(diselenide bond)。
[0015]在一些实施方案中，所述二硒键是分子间键或分子内键。
[0016]在一些实施方案中，所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体的半衰期比不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体的半衰期高至少1.1倍。
[0017]在一些实施方案中，所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体与SEQ ID NO:1具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列一致性。
[0018]在一些实施方案中，所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体包括序列，所述序列与SEQ ID NO:1的至少25、50、75、100、125、150、175、200、225、250或261个连续氨基酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列一致性。
[0019]在一些实施方案中，所述一种或多种非标准氨基酸位于SEQ ID NO:1的102位、SEQ ID NO:1的105位、SEQ ID NO:1的174位、或SEQ ID NO:1的210位。
[0020]在一些实施方案中，在102位处的非标准氨基酸由键直接连接到在105位处的非标准氨基酸。
[0021]在一些实施方案中，在174位处的非标准氨基酸由键直接连接到在210位处的非标准氨基酸。
[0022]在一些实施方案中，所述键是二硒键。
[0023]在一些实施方案中，所述二硒键位于相应重组酶中的二硫键的位置，所述相应重组酶没有所述一种或多种非标准氨基酸。
[0024]在一些实施方案中，所述相应稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体的所
述Tm小于37℃。
[0025]在一些实施方案中，所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体的所述Tm大于37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃。
[0026]在一些实施方案中，所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体的所述Tm比所述相应重组酶、其功能片段或其变异体的所述Tm高至少10℃。
[0027]在一些实施方案中，所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体的所述Tm比所述相应重组酶、其功能片段或其变异体的所述Tm高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，其包括稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽、其功能片段，或其变异体，所述稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽包括一种或多种非标准氨基酸。2.一种组合物，其包括稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽、其功能片段，或其变异体，所述稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽包括一种或多种非标准氨基酸，其中所述稳定化的DNase I多肽在环境中对DNA底物的内切核酸酶活性高于不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体对所述DNA底物的内切核酸酶活性。3.一种组合物，其包括稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽、其功能片段，或其变异体，所述稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽包括一种或多种非标准氨基酸，其中在不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体不稳定化的环境中，所述稳定化的DNase I多肽没有不稳定化。4.一种组合物，其包括稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽、其功能片段，或其变异体，所述稳定化的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)多肽包括一种或多种非标准氨基酸，其中所述稳定化的DNase I多肽的解链温度(Tm)比不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体的T
m
高至少5℃。5.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的组合物，其中所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体的解链温度(Tm)比不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应重组酶、其功能片段或其变异体的T
m
高至少5℃。6.根据权利要求1、3或4中任一项所述的组合物，其中所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体在环境中对DNA底物的内切核酸酶活性高于不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体对所述DNA底物的内切核酸酶活性。7.根据权利要求1、2或4中任一项所述的组合物，其中在不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体不稳定化的环境中，所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体没有不稳定化。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种非标准氨基酸中的至少一个、两个、三个、四个或更多个是硒代半胱氨酸。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种非标准氨基酸中的至少两个由键直接连接。10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述一种或多种非标准氨基酸中的至少四个由键直接连接，其中所述一种或多种非标准氨基酸中的所述至少四个中的第一对由键直接连接，并且所述一种或多种非标准氨基酸中的所述至少四个中的第二对由键直接连接。11.根据权利要求9或10所述的组合物，其中所述键是二硒键。12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述二硒键是分子间键或分子内键。13.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的组合物，其中所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体的半衰期比不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体的半衰期高至少1.1倍。14.根据权利要求1
‑
13中任一项所述的组合物，其中所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体与SEQ ID NO:1具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列一致性。
15.根据权利要求1
‑
14中任一项所述的组合物，其中所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体包括序列，所述序列与SEQ ID NO:1的至少25、50、75、100、125、150、175、200、225、250或261个连续氨基酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列一致性。16.根据权利要求1
‑
15中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种非标准氨基酸位于(a)SEQ ID NO:1的102位，(b)SEQ ID NO:1的105位，(c)SEQ ID NO:1的174位，或者(d)SEQ ID NO:1的210位。17.根据权利要求16所述的组合物，其中在102位处的非标准氨基酸由键直接连接到在105位处的非标准氨基酸。18.根据权利要求16或17所述的组合物，其中在174位处的非标准氨基酸由键直接连接到在210位处的非标准氨基酸。19.根据权利要求17或18所述的组合物，其中所述键是二硒键。20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述二硒键位于无所述一种或多种非标准氨基酸的相应重组酶中的二硫键的位置。21.根据权利要求4、5和8
‑
20中任一项所述的组合物，其中所述相应稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体的所述Tm小于37℃。22.根据权利要求4、5和8
‑
21中任一项所述的组合物，其中所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体的所述Tm大于37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃。23.根据权利要求4、5和8
‑
22中任一项所述的组合物，其中所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体的所述Tm比所述相应重组酶、其功能片段或其变异体的所述Tm高至少10℃。24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体的所述Tm比所述相应重组酶、其功能片段或其变异体的所述Tm高至少15℃。25.根据权利要求1
‑
24中任一项所述的组合物，其中所述稳定化的DNase I多肽、其功能片段或其变异体在环境中的半衰期比不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体在所述环境中的半衰期的高至少1.1倍。26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述DNase I多肽、其功能片段或其变异体在所述环境中的所述半衰期大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或更长。27.根据权利要求25或26所述的组合物，其中所述DNase I多肽、其功能片段或其变异体在所述环境中的所述半衰期大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24天或更长。28.根据权利要求2和5
‑
27中任一项所述的组合物，其中所述稳定化的DNase I多肽在环境中对DNA底物的内切核酸酶活性比不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体对所述DNA底物的内切核酸酶活性高至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。
29.根据权利要求2和5
‑
27中任一项所述的组合物，其中所述稳定化的DNase I多肽在存在于环境中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50分钟之后、对DNA底物的内切核酸酶活性比不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体在存在于所述环境中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50分钟之后、对所述DNA底物的内切核酸酶活性高至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。30.根据权利要求2和5
‑
29中任一项所述的组合物，其中所述稳定化的DNase I多肽在存在于环境中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18或24小时之后、对DNA底物的内切核酸酶活性比不包括所述一种或多种非标准氨基酸的相应DNase I多肽、其功能片段或其变异体在存在于所述环境中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18或24小时之后、对所述DNA底物的内切核酸酶活性高至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。31.根据权利要求2和5
‑
30中任一项所述的组合物，其中所述DNA底物是基因组DNA。32.根据权利要求2、3和5
‑
31中任一项所述的组合物，其中所述环境是温度为4℃
‑
98℃的环境。33.根据权利要求2、3和5
‑
32中任一项所述的组合物，其中所述环境是含有裂解缓冲液的环境。34.根据权利要求2、3和5
‑
33中任一项所述的组合物，其中所述环境是浓度为0.01％至20％的洗涤剂的环境。35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述洗涤剂是非离子型洗涤剂。36.根据权利要求34所述的组合物，其中所述洗涤剂是离子型洗涤剂。37.根据权利要求2、3和5
‑
36中任一项所述的组合物，其中所述环境包括浓度为0.01mM至100mM的二价阳离子。38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述二价阳离子选自包含Mg
2+
、Mn
2+
、Ca
2+
、Co
2+
和Zn
2+
的组。39.根据权利要求2、3和5
‑
38中任一项所述的组合物，其中所述环境包括浓度为0.01mM至100mM的还原剂。40.根据权利要求2、3和5
‑
39中任一项所述的组合物，其中所述环境具有5
‑
9的pH。41.根据权利要求2、3和5
‑
40中任一项所述的组合物，其中所述环境具有6
‑
8的pH。42.根据权利要求2、3和5
‑
41中任一项所述的组合物，其中所述环境具有7
‑
8的pH。43.根据权利要求2、3和5
‑
42中任一项所述的组合物，其中所述环境具有10mM至1M的盐浓度。44.根据权利要求2、3和5
‑
43中任一项所述的组合物，其中所述环境是在液滴内。45.根据权利要求2、3和5
‑
44中任一项所述的组合物，其中所述环...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔，
申请(专利权)人：格罗生物科学公司，
类型：发明
国别省市：