一种高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3-SA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3

【技术实现步骤摘要】
一种高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
‑
SA及其应用


[0001]本专利技术属于生物合成
，具体涉及一种高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
‑
SA及其应用。

技术介绍

[0002]谷胱甘肽是一种三肽活性物质，广泛存在于动物、植物和微生物中，具有保护和调节细胞内氧化还原平衡的作用。其分子量为307.33，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，在各种生物的体内含量各不相同，其中在酵母和动物内脏中含量较高。GSH在临床领域也上发挥着广泛的作用，在肝病、肾病以及心血管疾病上都具有显著的疗效。
[0003]GSH的主要特征是由于其具有一个γ酰胺键和一个巯基基团。在大多数原核和真核生物中由两步反应生成，第一步由谷氨酸和半胱氨酸在GSH1的作用下生成谷氨酰半胱氨酸，之后该产物再与甘氨酸在GSH2的作用下反应生成GSH，第一步反应的酶是生成GSH的关键酶，受产物的反馈抑制，两步酶皆是ATP依赖型，反应均需消耗1分子的ATP。
[0004]已报道的GSH合成方法有化学合成法、酶转化法和发酵法。化学合成法采用三种原料利用化学工艺合成GSH，成本高昂，且对环境有污染。酶法采用三种原料、ATP及酶反应生成GSH，此法核心是筛选出具有高活性的合成酶，但成本高，目前大多还在研究中。发酵法是微生物利用廉价的原料来生长积累高浓度的GSH，之后进行下一步的分离纯化。成本低、纯度高、无污染，是目前生产GSH的主要方法。
[0005]为此，已经尝试利用多种微生物实现对GSH的生产。在此方面的研究中，前人经常采用诱变或者基因工程来提高酶的活性，或者通过优化发酵条件提高前体的利用。由于酵母中GSH含量较高，遗传背景清晰，所以经常被用作生产GSH的优良宿主。目前主要工业生产以发酵法为主，生产宿主为酵母、大肠等。毕赤酵母由于具有食品安全级微生物的状态，且外源表达以整合为主，无需高昂的诱导剂，成为高密度发酵生产外源蛋白以及其他生物产品的优良宿主。
[0006]限制GSH的发酵产量的因素有三个，GSH合成酶的活性、半胱氨酸及ATP的供应。半胱氨酸可以通过外源添加补充，但过量的半胱氨酸会导致合成时期ATP的供应不足。
[0007]Alfafara等研究发现半胱氨酸(Cys)是提高GSH的关键氨基酸。但在进行高密度发酵生产时，细胞通过代谢合成的Cys远不能满足合成GSH的需要。因此外源添加Cys是一种有效策略，而且也确实得到了GSH的大规模生产。然而当Cys过量添加时，使得充当能量载体的ATP成为GSH生产的限制因素。为解决此问题，Liang等通过直接添加ATP使GSH产量提高11％，ATP属于昂贵原料，放大生产不现实。又如Wang等研究利用柠檬酸盐作为辅能量底物促进NADH的产生，进而通过电子传递链加强ATP的产生，使菌株SAM和GSH产量及其联产产量提高27.5％，然而这种方法不能提高足够的ATP来满足高GSH的生产需要。
[0008]利用传统代谢工程提高ATP的供给对于高耗能反应的进行是良好的策略。据报道，在毕赤酵母表达VHB蛋白，增加菌体摄氧能力，进而提高ATP的供应，使得SAM的产量相较对照提高19倍。Tani等发现来自酿酒酵母的ADK是AMP转化至ATP的限速步骤，后来在Harit利
用毕赤酵母产SAM的研究中也得到了证实。
[0009]综上，ATP是谷胱甘肽合成的主要限制因子，如何提高ATP的供应，有效提升谷胱甘肽的产量，是本领域亟需解决的技术问题。

技术实现思路

[0010]专利技术目的：研究发现添加ATP或者代谢改造促进ATP的再生均对谷胱甘肽的合成有促进作用，但存在成本高昂或效果有限的问题。为了克服现有技术中存在的该问题与不足，本专利技术提供一种高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
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SA及其应用，增强了胞内GSH的合成，对于促进谷胱甘肽的合成或者其余耗能产物的生产具有普遍的意义。
[0011]技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0012]本专利技术的一个目的是，提供一种高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
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SA，以毕赤酵母为宿主，异源表达来源于酿酒酵母的谷胱甘肽合成酶Scgsh1和Scgsh2基因及腺苷激酶Scadk1基因，获得的工程菌命名为毕赤酵母菌株G3
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SA。
[0013]进一步的，所述毕赤酵母选用毕赤酵母Pichia pastoris GS115，该菌株购自淼灵质粒平台。
[0014]进一步的，所述谷胱甘肽合成酶Scgsh1和Scgsh2基因、所述腺苷激酶Scadk1基因的核苷酸序列分别如SEQ.NO.01～SEQ.NO.03所示。
[0015]本专利技术的另一个目的是，提供一种高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
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SA的构建方法：以毕赤酵母为宿主，首先异源表达来源于酿酒酵母的谷胱甘肽合成酶Scgsh1(Gene ID:853344)和Scgsh2(Gene ID:854108)基因，获得的工程菌命名为G3；再以G3为宿主，异源表达来源于酿酒酵母的腺苷激酶Scadk1(Gene ID:851812)基因，获得的工程菌命名为毕赤酵母菌株G3
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SA。
[0016]更进一步的，具体方法为以pGAPZA为初始质粒，采用BglⅡ与BamHⅠ酶切，并将插入了XbaⅠ的片段插入其中，所构质粒命名为pGAPZT。在pGAPZT的BglⅡ与XbaⅠ之间插入P
AOX1
序列。Scadk1基因(Gene ID:851812)经S.cerevisiae BY4741基因组PCR扩增后获取，所得片段连接在pGAPZT中并用SacⅠ线性化电转至G3菌株中，所得菌株经含有2mg/L Zeocin的YPD平板筛选后，所得菌株名为为G3
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SA。
[0017]进一步的，所述腺苷激酶Scadk1基因的异源表达的发酵过程中，在发酵时间15
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16h时外源添加4g/L的柠檬酸钠。
[0018]本专利技术的另一个目的是，提供一种上述高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
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SA的构建方法过程中得到的质粒。
[0019]本专利技术的另一个目的是，提供编码如上述的高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
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SA的基因。
[0020]本专利技术的另一个目的是，提供一种制备谷胱甘肽的方法，采用上述的高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
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SA，或上述方法构建的高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
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SA，通过发酵方法合成谷胱甘肽。
[0021]本专利技术的另一个目的是，提供由上述方法制备得到的谷胱甘肽。
[0022]有益效果：本专利技术提供的一种高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
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SA及其应用，与现有技术相比，具有以下优势：本专利技术以毕赤酵母GS115为宿主，异源表达来源于酿酒酵母的
Scgsh1和Scgsh2基因，获得了GSH的过量生产，将工程菌命名为G3；在此基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
‑
SA，其特征在于：以毕赤酵母为宿主，异源表达来源于酿酒酵母的谷胱甘肽合成酶Scgsh1和Scgsh2基因及腺苷激酶Scadk1基因，获得的工程菌命名为毕赤酵母菌株G3
‑
SA。2.根据权利要求1所述的高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
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SA，其特征在于：所述毕赤酵母选用毕赤酵母Pichia pastoris GS115。3.根据权利要求1所述的高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
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SA，其特征在于：所述谷胱甘肽合成酶Scgsh1和Scgsh2基因、所述腺苷激酶Scadk1基因的核苷酸序列分别如SEQ.NO.01～SEQ.NO.03所示。4.根据权利要求1所述的一种高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
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SA的构建方法，其特征在于：以毕赤酵母为宿主，首先异源表达来源于酿酒酵母的谷胱甘肽合成酶Scgsh1、Scgsh2基因，获得的工程菌命名为G3；再以G3为宿主，异源表达来源于酿酒酵母的腺苷激酶Scadk1基因，获得的工程菌命名为毕赤酵母菌株G3
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SA。5.根据权利要求4所述的高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株G3
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SA的构建方法，其特征在于：具体方法为以pGAPZA为初始质粒，采用BglⅡ与BamHⅠ酶切，并将插入了XbaⅠ...

【专利技术属性】
技术研发人员：许正宏，史劲松，徐国强，高宇豪，徐建国，付静，曹峥，吴勇杰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：