一种改造基因BBD29_04920的产L-谷氨酸的重组菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种对棒杆菌中BBD29_04920基因编码序列引入点突变或改进其表达的方法，所述方法可以使带有所述突变的菌株提高谷氨酸的发酵产量。所述点突变是使BBD29_04920基因序列第1560位碱基由胞嘧啶(C)突变为腺嘌呤(A)，使编码的相应氨基酸序列第520位天冬酰胺被赖氨酸。被赖氨酸。

【技术实现步骤摘要】
一种改造基因BBD29_04920的产L
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谷氨酸的重组菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程和微生物
，具体涉及一种产L
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谷氨酸的重组菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]L
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谷氨酸是一种重要的氨基酸，被应用于食品、临床药物及其它方面。
[0003]传统上，L
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谷氨酸主要是通过发酵，用属于短杆菌属、棒状杆菌属或微菌属等菌属的生产L
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谷氨酸的细菌或其突变体进行生产。
[0004]L
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谷氨酸是由微生物细胞内柠檬酸循环的中间产物α
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酮戊二酸通过生物合成而来的。由α
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酮戊二酸通过铵离子的同化作用来形成L
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谷氨酸的生物合成途径有两条。其中一条途径是在有高浓度的铵离子存在的情况下，通过谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，GDH)的催化来合成L
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谷氨酸。另一条途径(GS/GOGAT途径)是由谷氨酰胺合成酶及谷氨酰胺
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酮戊二酸氨基转移酶来合成L
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谷氨酸。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)催化L
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谷氨酸和铵离子转化为谷氨酰胺的反应；谷氨酰胺
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酮戊二酸氨基转移酶(glutamine
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oxoglutaric acid amino transferase，也称“谷氨酸合成酶”(glutamate synthase，GOGAT)催化L
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谷氨酸合成反应，在该反应中，由已经由GS合成的一分子的谷氨酰胺和一分子的α
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酮戊二酸分子合成两分子的L
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谷氨酸。
[0005]对发酵法生产L
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氨基酸的改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气；或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度；或涉及将发酵液加工成合适的产品形式，例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱；或可以涉及相关微生物本身的固有性能性质。
[0006]用于改善这些微生物的性能性质的方法包括诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L
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氨基酸等。
[0007]虽然已有大量方法可以提高L
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谷氨酸的生产能力，但是为了满足日益增加的需求，仍需要发展生产L
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谷氨酸的方法。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是开发用于改善细菌的L
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谷氨酸生产能力的新技术，从而提供一种有效生产L
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谷氨酸的方法。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术的专利技术人通过研究发现，对细菌中的基因BBD29_04920或其同源基因，可以通过修饰所述基因或改善其表达，能够改善细菌的L
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谷氨酸生产能力。基于这些发现，完成了本专利技术。
[0010]本专利技术提供了生成L
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谷氨酸的细菌，其中编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的表达改善。本专利技术还提供了通过使用所述微生物生产L
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谷氨酸的方法。
[0011]本专利技术的第一个方面提供了生成L
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谷氨酸的细菌，其具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的改善的表达。根据本专利技术，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。
[0012]所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列是基因BBD29_04920或其同源基因编码的蛋白。
[0013]所述细菌与未修饰菌株相比具有增强的L
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谷氨酸生产能力。
[0014]在本专利技术中，术语“具有L
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谷氨酸生产能力的细菌”是指具有在培养基和/或细菌的细胞中以下述程度产生并累积目的L
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谷氨酸的能力，使得当细菌在培养基中培养时可以收集L
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谷氨酸的细菌。具有L
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谷氨酸生产能力的细菌可以是能够以比未修饰菌株可获得的量更大的量在培养基和/或细菌的细胞中积累目的L
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谷氨酸的细菌。
[0015]术语“未修饰菌株”是指尚未以使得具有特定特征的方式进行修饰的对照菌株。即，未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。
[0016]具有L
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谷氨酸生产能力的细菌可以是能够在培养基中以优选0.5g/L以上，更优选1.0g/L以上的量积累目标L
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谷氨酸的细菌。
[0017]在本专利技术中，除非另有说明，术语“L
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谷氨酸”是指游离形式的L
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谷氨酸、其盐或其混合物。
[0018]所述多核苷酸可以编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，术语“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽模块之间的百分比同一性。可以通过使用本领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可以通过BLAST算法测定此类序列同源性。
[0019]可以如下增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。
[0020]可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生成L
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谷氨酸的细菌，其特征在于，具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的改善的表达；优选，所述改善的表达是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。2.如权利要求1所述的细菌，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第520位天冬酰胺被不同的氨基酸所取代；优选第520位天冬酰胺被赖氨酸所取代。3.如权利要求1
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2任一项所述的细菌，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。4.如权利要求1
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3任一项所述的细菌，其特征在于，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第1560位碱基发生突变而形成的；优选，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第1560位碱基由胞嘧啶(C)突变为腺嘌呤(A)；优选，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。5.如权利要求1
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4任一项所述的细菌，其特征在于，所述细菌是棒杆菌属细菌，优选嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacte...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟刚，贾慧萍，魏爱英，赵春光，苏厚波，杨立鹏，马风勇，周晓群，郭小炜，田斌，
申请(专利权)人：内蒙古伊品生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：