基于隐球酵母Y3胞内酶降解赭曲霉毒素A的用途制造技术

本发明专利技术属于生物防治技术领域，涉及一种基于隐球酵母Y3胞内酶降解赭曲霉毒素A的用途；步骤为：首先将隐球酵母Y3接入NYDB培养基中，培养活化后，取菌液涂布于NYDA培养基；然后，挑选单菌落接种到PM培养基中，培养后经离心得到菌体，无菌蒸馏水清洗后，稀释成1

【技术实现步骤摘要】
基于隐球酵母Y3胞内酶降解赭曲霉毒素A的用途


[0001]本专利技术属于生物降解毒素的方法，具体涉及一种基于隐球酵母Y3胞内酶降解赭曲霉毒素A的用途。

技术介绍

[0002]真菌毒素是由真菌类微生物产生的次级代谢产物，到目前为止，人们发现了至少300种真菌毒素。世界上毒性最强的五类真菌毒素中，赭曲霉毒素A排列第二，其最明显的毒性作用是肾毒性，其次还有肝脏、免疫毒性等，被国际癌症研究机构列为2B类人类致癌物。
[0003]除了严重的毒性作用，赭曲霉毒素A在食品和饲料中污染严重。自然界中产生赭曲霉毒素A的主要霉菌有两类，第一类是Aspergillus ochraceus和Penicillium verrucosum，这两类真菌的寄主主要是农作物，包括玉米、小麦、水稻等，该类霉菌在热带和亚热带地区发病较为严重；还有一种霉菌是Aspergillus carbonarins，其寄主主要是葡萄，该类霉菌在寒冷的地区发病比较严重。到目前为止，赭曲霉毒素A已经被发现存在于各类食品中，如酱油，葡萄及其制品，以及肉类产品和咖啡中。赭曲霉毒素A在人体中的存在也是令人担忧的问题，2019年基于葡萄牙地区的研究发现，超过90％的儿童的尿液中被检测到该毒素。
[0004]由于赭曲霉毒素A极强的毒性和广泛的污染，在食品和饲料中控制其含量是保障食品安全的重要举措。赭曲霉毒素A是由
‑
羧基
‑5‑
氯
‑8‑
羟基
‑
3，4
‑
二氢
‑3‑<br/>R
‑
甲基异香豆素(赭曲霉毒素α)和L
‑
β
‑
苯丙氨酸通过酰胺键连在一起的聚酮类化合物，耐酸性和高温环境，在自然环境中较难降解。一般通过断裂酰胺键，生成赭曲霉毒素α和L
‑
β
‑
苯丙氨酸达到解毒的效果。
[0005]目前对赭曲霉毒素A的控制方法包括物理方式、化学方式、生物方式。物理方式降解赭曲霉毒素A包括吸附和加热降解；吸附是常见的脱除毒素的方法，但是不能彻底降解毒素，使其残留在环境中，造成二次污染；加热也是脱除赭曲霉毒素A的有效方式，但是容易造成产品品质降低的问题。化学方式降解赭曲霉毒素A也是常见的脱毒方式，而且已经研究出的降解赭曲霉毒素A的化学方式多样化，如利用过氧化物酶(POD)、蛋白质和糖类降解赭曲霉毒素A，但是操作复杂，成本较高。
[0006]近年来，采用微生物及其产生的酶降解毒素成为研究的热点，虽然已有较多的酵母菌、乳酸菌和霉菌被发现具有降解赭曲霉毒素A的功效，但是发掘出来的降解酶的种类有限、而且降解效果不佳，因此，挖掘新的高效降解酶是非常必要的。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的缺陷与不足，本专利技术提供一株分离筛选自土壤的隐球酵母(Cryptococcus podzolicus)Y3，基于隐球酵母Y3的胞内酶降解赭曲霉毒素A，其具有高安全性和极高的降解效果。
[0008]本专利技术所提供的降解赭曲霉毒素A的隐球酵母系从镇江市句容市果园收集的土壤
中筛选分离到的，在NYDA固体培养基平板上28℃培养3d，进行形态学观察；已经对该菌株的5.8S rDNA
‑
ITS区序列进行分析并进行了分子生物学鉴定。同时，本专利技术所提供的酵母菌株，现保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M2017505，建议的分类命名为隐球酵母(Cryptococcus podzolicus)Y3。此外，本专利技术所利用的菌株申请人已经申请中国专利技术专利，CN201711183834.0，专利技术名称为：一株降解桔霉素的酵母菌及应用。
[0009]为了实现以上目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0010](1)配制菌悬液：将隐球酵母Y3接入NYDB培养基中，在28～30℃、180rpm震荡条件下，培养20～24h，进行活化，得到活化后的菌液；然后取活化后的菌液涂布于NYDA固体培养基，培养温度28℃～30℃，时间48
‑
60h；然后，挑选NYDA固体培养基生长的隐球酵母Y3单菌落接种到PM培养基中进行培养，培养后经离心得到菌体，并用无菌蒸馏水清洗数次，清洗后再次离心，收集菌体用无菌水稀释成菌悬液；
[0011](2)取步骤(1)制备的菌悬液，接种于PM培养基中，在28～30℃、180rpm震荡条件下，培养20～24h，离心收集酵母菌体，无菌蒸馏水清洗后再次离心收集酵母菌体，然后加入液氮速冻菌体，进行研磨，得到粉末状的菌体；然后将粉末状的菌体加入Tris
‑
HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM，pH 7.1)重悬，震荡后进行冰浴处理，处理后离心，收集上清液，即为胞内粗酶液；
[0012](3)再将步骤(2)中得到的胞内粗酶液通过针孔滤膜过滤除菌，得到胞内酶溶液；在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A，在避光环境下，震荡培养，即可实现快速降解赭曲霉毒素A的用途。
[0013]优选的，步骤(1)中所述离心的转速为7000r/min，时间为10min。
[0014]优选的，步骤(1)中所述的NYDA培养基成分如下：以1000mL计，牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，余量为蒸馏水，115℃湿热灭菌15min。
[0015]优选的，步骤(1)中所述的NYDB培养基成分如下：以1000mL计，酵母膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，余量为蒸馏水，pH自然，115℃湿热灭菌15min。
[0016]优选的，步骤(1)中所述PM培养基成分如下：麦芽糖2g，蔗糖10g，酵母浸5g，蛋白胨5g，一级蒸馏水1000mL，115℃湿热灭菌15min。
[0017]优选的，步骤(1)中所述单菌落接种到PM培养基中进行培养的温度为28℃～30℃，时间为48h。
[0018]优选的，步骤(1)中所述用无菌蒸馏水清洗数次具体为2～3次；所述菌悬液的浓度为1
×
108cells/mL。
[0019]优选的，步骤(2)中所述菌悬液接种于PM培养基中的接种量为1％～2％；即菌悬液为PM培养基体积的1％～2％。
[0020]优选的，步骤(2)中所述震荡的时间为1～2min；所述冰浴处理的时间为30～35min；所述离心的条件为：4℃，15～20min、11000
×
g。
[0021]优选的，步骤(3)中所述针孔滤膜的孔径为0.22μm，所述滤膜为有机滤膜；所述震荡培养的条件为：28℃，180rpm，时间0～3h。
[0022]本专利技术的优点：
[0023](1)本专利技术提供隐球酵母Y3的胞内酶可以高效快速降解赭曲霉毒素A，胞内酶与赭
曲霉毒素A混合后就能够即时降解，而且降解效果显著；在0h，针对OTA初始浓度为1μg/mL，降解率为83.2％；在OTA初始浓度提高为10μg/mL，在0h本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于隐球酵母Y3胞内酶降解赭曲霉毒素A的用途，其特征在于，具体步骤如下：(1)配制菌悬液：将隐球酵母Y3接入NYDB培养基中，在28～30℃、180rpm震荡条件下，培养20～24h，进行活化，得到活化后的菌液；然后取活化后的菌液涂布于NYDA固体培养基，培养温度28℃～30℃，时间48
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60h；然后，挑选NYDA固体培养基生长的隐球酵母Y3单菌落接种到PM培养基中进行培养，培养后经离心得到菌体，并用无菌蒸馏水清洗数次，清洗后再次离心，收集菌体用无菌水稀释成菌悬液；(2)取步骤(1)制备的菌悬液，接种于PM培养基中，在28～30℃、180rpm震荡条件下，培养20～24h，离心收集酵母菌体，无菌蒸馏水清洗后再次离心收集酵母菌体，然后加入液氮速冻菌体，进行研磨，得到粉末状的菌体；然后将粉末状的菌体加入Tris
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HCl缓冲液重悬，震荡后进行冰浴处理，处理后离心，收集上清液，即为胞内粗酶液；(3)再将步骤(2)中得到的胞内粗酶液通过针孔滤膜过滤除菌，得到胞内酶溶液；在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A，在避光环境下，震荡培养，即可实现降解赭曲霉毒素A的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(1)中所述离心的转速为7000r/min，时间为10min。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(1)中所述的NYDA培养基成分如下：以1000mL计，牛...

【专利技术属性】
技术研发人员：张红印，魏美林，张晓云，杨其亚，赵利娜，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：