肾细胞癌miRNA分子标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了肾细胞癌miRNA分子标志物，作为转移标志物，用于诊断和/或评估肾细胞癌预后及发生转移的风险；或者，作为肾细胞癌的特异性分子靶标，应用于肾细胞癌的治疗；所述miRNA分子标志物包括miR

【技术实现步骤摘要】
肾细胞癌miRNA分子标志物及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，更具体地说，它涉及肾细胞癌miRNA分子标志物及其应用。

技术介绍

[0002]肾细胞癌(RCC)是世界范围内常见的癌症，约占成人恶性肿瘤的2
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3％。据报道，2017年美国约有63990例RCC新发病例，超过14400例肾癌相关死亡病例。在中国，RCC的发病率呈上升趋势，2014年约有68300例新发RCC，25600例肾癌相关死亡。转移播散是影响RCC预后的最重要因素。原发转移患者的5年生存率约为10％，非转移和晚期转移患者的5年生存率为70％～90％。初诊时，近60％的患者为局部癌，20％为远处转移。RCC的转移扩散主要发生在骨、肺、肝或脑。RCC的转移是其发病率高、预后差的原因。80％以上的RCC患者在确诊远处转移后存活时间不足5年。因此，了解RCC发生、发展特别是转移的作用机制，并进行适当的干预，对于提高RCC的临床诊治水平、延长病人的生存时间具有非常重要的意义。然而，目前临床上尚无理想的分子指标来评估RCC患者预后及发生转移的风险。因此，寻找新型的RCC转移及预后标志物是当前丞待解决的热点问题。
[0003]随着基因组学和转录组的快速发展，越来越多的证据表明，非编码RNAs在各种癌症的发生、发展和转移中发挥着重要作用，可以作为癌症诊断、治疗的分子标志物。众所周知，微小RNAs(miRNAs)通过转录降解或抑制其靶基因的表达进行负向调控。许多研究表明，miRNAs在人类肿瘤的发展过程中起着关键的调控作用，通过调控与疾病发生、发展相关的基因的表达来影响癌症的进展。然而，究竟哪些miRNAs能作为RCC转移及预后标志物仍有待于进一步的研究。

技术实现思路

[0004]为了弥补现有技术的不足，本专利技术通过高科技生物技术筛选出在肾细胞癌组织及其转移癌组织中呈现差异表达的miRNA分子标志物，通过检测miRNAs分子标志物的表达水平，与参照水平进行对比，来判断肾细胞癌患者发生转移的风险以及预后评估。同时，该miRNA分子标志物可以作为肾细胞癌的特异性分子靶标，应用于肾细胞癌的精准治疗。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：肾细胞癌miRNA分子标志物，作为转移标志物，用于诊断和/或评估肾细胞癌预后及发生转移的风险；或者，作为肾细胞癌的特异性分子靶标，应用于肾细胞癌的治疗；所述miRNA分子标志物包括miR
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328、miR
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502和miR
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504中的一种或者多种。
[0006]一种通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中miR
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328、miR
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502和/或miR
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504基因的表达水平的检测试剂；所述检测试剂选自特异性识别miR
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328、miR
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502和/或miR
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504的探针；或者，所述检测试剂选自特异性扩增miR
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328、miR
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502和/或miR
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504的引物；或者，所述检测试剂选自特异性分析miR
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328、miR
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502和/或miR
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504的芯片。
[0007]核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染
料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
[0008]核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。
[0009]核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
[0010]将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。
[0011]本专利技术可在检测前或同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT
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PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT
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PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。
[0012]通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT
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PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.肾细胞癌miRNA分子标志物，其特征在于，作为转移标志物，用于诊断和/或评估肾细胞癌预后及发生转移的风险；或者，作为肾细胞癌的特异性分子靶标，应用于肾细胞癌的治疗；所述miRNA分子标志物包括miR
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328、miR
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502和miR
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504中的一种或者多种。2.一种通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中miR
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328、miR
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502和/或miR
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504基因的表达水平的检测试剂；所述检测试剂选自特异性识别miR
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328、miR
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502和/或miR
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504的探针；或者，所述检测试剂选自特异性扩增miR
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328、miR
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502和/或miR
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504的引物；或者，所述检测试剂选自特异性分析miR
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328、miR
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502和/或miR
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504的芯片。3.权利要求2所述的检测试剂，其特征是：所述特异性扩增miR
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328、miR
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502和/或miR
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504的引物序列如SEQ ID NO.5
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10所示。4.一种体外检测miR
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328、miR
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502和/或miR
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504表达水平的相关产品，...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹志飞，张永胜，涂健，杨天宇，钮慧，沈珊珊，
申请(专利权)人：核工业总医院，
类型：发明
国别省市：