生物乙醇发酵中植物乳杆菌提高酿酒酵母乙醇耐受力的方法属于发酵工程范畴。本发明专利技术模拟酿酒酵母发酵染菌，分别在植物乳杆菌与酿酒酵母混合培养和经梯度浓度的植物乳杆菌驯化酿酒酵母的条件下，测定了酿酒酵母在的氧化及乙醇耐受性；在保藏过程中，植物乳杆菌的存在有助于维持酿酒酵母的乙醇耐受性。本发明专利技术是当生物乙醇发酵过程中受到染菌胁迫时，污染的乳酸菌调控酿酒酵母细胞的氧化及乙醇耐受性，使之更好响应乙醇胁迫。之更好响应乙醇胁迫。
【技术实现步骤摘要】
生物乙醇发酵中植物乳杆菌提高酿酒酵母乙醇耐受力的方法
[0001]一种采用植物乳杆菌作为污染菌，将植物乳杆菌与酿酒酵母混合培养，以模拟生物乙醇发酵中的染菌。但当酿酒酵母发酵过程中受到染菌胁迫时，污染的植物乳杆菌可以提高酿酒酵母乙醇耐受能力，使之产生更多乙醇。属于发酵工程范畴。
技术介绍
[0002]随着世界经济的迅速发展，传统的化石能源逐渐耗尽，而且造成越来越严重的环境污染，因此人们对可再生清洁能源的需求日益迫切。生物燃料乙醇的出现是时代需要的产物，作为一种可再生的无污染新能源，其应用前景广阔。
[0003]生物乙醇目前主要通过生物发酵进行生产，酿酒酵母是主要的发酵菌种。在生物乙醇的液态发酵生产过程中，酿酒酵母生长易受到杂菌污染和乙醇胁迫，进而降低了生物乙醇的终产量。乳酸菌是最主要的污染杂菌，其可通过竞争生长空间和营养物质，以及分泌乳酸等，对酿酒酵母细胞生长进行抑制。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是提供一种生物乙醇发酵中植物乳杆菌提高酿酒酵母乙醇耐受能力的方法。其特点是以植物乳杆菌ATCC 8014作为污染杂菌，将其与酿酒酵母S288c混培养。通过混合培养发酵来模拟工业燃料乙醇发酵过程的染菌过程，从而提高酿酒酵母提高乙醇的耐受力。
[0005]本实验所用的酿酒酵母S288c(ATCC 204508)和植物乳杆菌ATCC 8014，均购买自中国微生物菌种保藏中心。
[0006]1.本实验针对植物乳杆菌的活化及发酵培养基均为MRS培养基，其配方为：5g酵母浸粉，10g蛋白胨，20g葡萄糖，10g牛肉粉，2g柠檬酸氢二铵，5g乙酸钠，2g磷酸氢二钾，0.58g硫酸镁，0.25g硫酸锰，1mL吐温80，用去离子水补至1L。固体培养基继续添加20g琼脂粉。
[0007]本实验针对酿酒酵母所用的活化及发酵培养基均为YPD培养基，其配方为：20g葡萄糖，20g酵母浸粉，20g蛋白胨，用去离子水补至1L。
[0008]本实验针对实验材料的灭菌条件均为：115℃灭菌20min。
[0009]2.植物乳杆菌提高酿酒酵母氧化耐受性应对乙醇胁迫，其特征如下：
[0010](1)酿酒酵母培养：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevistae)S288c接种于YPD培养基中，30℃、150rmp条件下培养12小时，进行菌种复苏；将活化菌株再次接种于新鲜YPD培养基中，培养10小时，通过血球计数板计数来确定酿酒酵母菌种量。在计数板上选取5个不同位置的方块分别统计酵母菌的个数，再4
×
105CFU/mL来确定酵母菌接种量。
[0011](2)植物乳杆菌培养：将植物乳杆菌接种于MRS培养基中，将其放在37℃静置恒温培养箱中活化培养12小时，通过平板计数法来确定植物乳杆菌菌接种量。取活化培养12小时的1mL菌液进行10倍梯度稀释，将每个10倍梯度稀释的菌液取100μL涂布于MRS平板，37℃静置培养24小时，选菌落数在30至300之间的平板进行计数，再按照1
×
108CFU/mL计算植物
乳杆菌的接种量。
[0012](3)按照确定的菌种量将植物乳杆菌和酵母接入YPD培养基中混合培养，并测定酵母细胞内活性氧的含量。
[0013]3.植物乳杆菌提高酿酒酵母的乙醇耐受性应对乙醇胁迫，其特征如下：
[0014](1)酿酒酵母培养：将酿酒酵母S288c接种于YPD培养基中，30℃、150rmp条件下培养12小时，进行菌种复苏；将活化菌株再次接种于新鲜YPD培养基中，培养10小时，通过血球计数板计数来确定酿酒酵母菌种量。在计数板上选取5个不同位置的方块分别统计酵母菌的个数，再4
×
105CFU/mL来确定酵母菌接种量。
[0015](2)植物乳杆菌培养：将植物乳杆菌接种于MRS培养基中，将其放在37℃静置恒温培养箱中活化培养12小时，通过平板计数法来确定植物乳杆菌菌接种量。取活化培养12小时的1mL菌液进行10倍梯度稀释，将每个10倍梯度稀释的菌液取100μL涂布于MRS平板，37℃静置培养24小时，选菌落数在30至300之间的平板进行计数，再按照1
×
108CFU/mL计算植物乳杆菌的接种量。
[0016](3)按照确定的菌种量将植物乳杆菌和酵母接入YPD培养基中混合培养，然后放入恒温摇床内，30℃，150rpm条件下持续恒温发酵24小时。在酿酒酵母生长的延迟期、指数期、稳定期分别取样，离心去除上清液，加入体积比为10％的乙醇浸泡0.5小时和2小时，浸泡到0.5小时和2小时取菌液，滴加亚甲基蓝染液，然后滴加至血球计数板用显微镜观察活细胞和死细胞个数。
[0017]研究发现，当植物乳杆菌和酿酒酵母共培养时，酵母细胞内的甘油和膜磷脂含量升高，这两种物质对细胞稳态起作用。因此当生物乙醇发酵过程中受到染菌胁迫时，污染的乳酸菌可调控酿酒酵母细胞的氧化及乙醇耐受性，使之更好响应乙醇胁迫。
附图说明
[0018]图1为活性氧含量的变化。
[0019]图2为不同生长周期体积比为10％乙醇浓度处理0.5小时，酿酒酵母细胞存活率。
[0020]图3为不同生长周期体积比为10％乙醇浓度处理2小时，酿酒酵母细胞存活率。
具体实施方式
[0021]一、植物乳杆菌提高酿酒酵母氧化耐受性应对乙醇胁迫具体实施方式如下：
[0022](1)培养基的配制：选取10个规格为250mL的锥形瓶，用去离子水洗净，并烘干备用。然后配制800mL YPD液体培养基，平均分装到8个锥形瓶内。另取2个锥形瓶来配制200mL MRS液体培养基，平均分装到2个锥形瓶内备用。其中一瓶MRS培养基再加入2g琼脂，变成固体培养基。此外，用报纸将G4和G5砂芯漏斗包好，准备灭菌。在115℃，20min条件下进行灭菌。
[0023](2)接种量：将酿酒酵母S288c接种于YPD培养基中，30℃、150rmp条件下培养12小时，进行菌种复苏；将活化菌株再次接种于YPD培养基中，培养10小时，取样1mL，取10μL滴加至盖有盖玻片的血球计数板来进行规定视野内的数目统计。在计数板上选取5个不同位置的方块分别统计酵母菌的个数，再4
×
105CFU/mL来确定酵母菌接种量。接着植物乳杆菌活化：将植物乳杆菌接种于MRS培养基中，将其放在37℃静置恒温培养箱中活化培养12小时，
取1mL菌液进行10倍梯度稀释，将每个10倍梯度稀释的菌液取100μL涂布于MRS平板，37℃静置培养24小时，选菌落数在30至300之间的平板进行计数，再按照1
×
108CFU/mL计算植物乳杆菌的接种量。
[0024](3)培养：按照步骤二计算好的菌种量，在1
‑
3号培养基内接入酿酒酵母进行纯培养，在4
‑
6号培养基内同时接入酿酒酵母和植物乳杆菌进行混培养。在30℃，150rpm条件下，6瓶接完菌的培养基在振荡培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.生物乙醇发酵中植物乳杆菌提高酿酒酵母乙醇耐受力的方法，其特征在于：所用的酿酒酵母S288c(ATCC 204508)和植物乳杆菌ATCC 8014，均购买自中国微生物菌种保藏中心；针对植物乳杆菌的活化及发酵培养基均为MRS培养基，其配方为：5g酵母浸粉，10g蛋白胨，20g葡萄糖，10g牛肉粉，2g柠檬酸氢二铵，5g乙酸钠，2g磷酸氢二钾，0.58g硫酸镁，0.25g硫酸锰，1mL吐温80，用去离子水补至1L；继续添加20g琼脂粉得到固体培养基；针对酿酒酵母所用的活化及发酵培养基均为YPD培养基，其配方为：20g葡萄糖，20g酵母浸粉，20g蛋白胨，用去离子水补至1L；针对实验材料的灭菌条件均为：115℃灭菌20min；具体包括以下步骤：(1)酿酒酵母培养：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevistae)S288c ATCC 204508接种于YPD培养基中，30℃、150rmp条件下培养1...
【专利技术属性】
技术研发人员：李灏，许亚丽，刘波，张晓茹，贺先琳，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：
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