酶切探针恒温检测呼吸道感染真菌病原体的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种酶切探针恒温检测呼吸道感染真菌病原体的试剂盒，将8个病原体靶标各自引物探针组合成三个多重核酸反应液。利用本发明专利技术中提供的核酸检测试剂盒，可实现三个单管多重恒温扩增检测呼吸道感染中的8种频率高发的真菌类病原体，且试剂盒操作简便，可实现床旁检测，整个检测用时在30min以内，能够快速精准地实现待测样本中多种真菌病原的筛查。

【技术实现步骤摘要】
酶切探针恒温检测呼吸道感染真菌病原体的试剂盒
本专利技术涉及核酸恒温检测
，特别涉及酶切探针恒温检测呼吸道感染真菌病原体的试剂盒。
技术介绍
呼吸道感染属于常见高发的疾病，在呼吸道感染中真菌感染多为念珠菌属、曲霉属、毛霉属、耶氏肺孢子菌等种类，其中念珠菌属中的白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌这5种，占人类真菌病原感染的95％。近年来广谱抗生素的使用，使得真菌感染的发病率逐年上升，引起的死亡率居高不下，所以，实现对真菌病原的早期快速特异诊断，对改善患者预后、提高患者生存率非常必要。目前临床上仍以镜检培养作为诊断真菌感染的金标准，但是培养所需要的周期长、镜检或者病理学检查对检验人员要求较高，存在较高的假阴性和假阳性，容易造成误诊和漏诊，延误患者病情，在临床应用上有一定的局限性。核酸检测病原更高效快速且特异性强，且随着分子生物学理论和技术的不断发展，核酸恒温扩增技术能在恒定温度下完成对DNA或者RNA的扩增，与传统的荧光PCR方法相比，核酸恒温扩增技术对仪器的要求也极大地简化，时间大大缩短，能满足实现操作简单、快速诊断的需求。但目前的核酸恒温扩增方法大多只能进行单管单重检测，这对于进行多重靶标的筛查检测时，将会费时、费力、且检测成本高。因此，建立一种基于核酸恒温扩增对呼吸道感染中的真菌病原体进行多重检测的试剂，对于实现患者的快速精准诊断具有重要指导意义。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种酶切探针恒温检测呼吸道感染真菌病原体的试剂盒，将8个病原体靶标各自引物探针组合成三个多重核酸反应液，第一个多重核酸反应液包括用于检测白色念珠菌、检测曲霉属和检测近平滑念珠菌的引物和探针；第二个多重核酸反应液包括用于检测光滑念珠菌、检测热带念珠菌和检测耶氏肺孢子菌的引物和探针；第三个多重核酸反应液包括用于检测毛霉属和检测克柔念珠菌的引物和探针；检测每一个真菌病原体的探针均是含有一个RNA碱基的探针和包括6条恒温扩增引物，所述探针荧光报告基团标记在RNA碱基的按5’-3’方向的左侧，荧光淬灭基团标记在RNA碱基的按5’-3’方向右侧；每个多重核酸反应液内检测每一个真菌病原体的探针标记不同的荧光基团。在一种实施方式中，第一个多重核酸反应液包括以下用于检测白色念珠菌、检测曲霉属和检测近平滑念珠菌的引物和探针，检测白色念珠菌的引物是SEQIDNo：1-6，探针是SEQIDNo：7所示；检测曲霉属的引物是SEQIDNo：8-13，探针是SEQIDNo：14；和检测近平滑念珠菌的引物是SEQIDNo：15-20，探针是SEQIDNo：21，，其中“CA”代表白色念珠菌，“Asp”代表曲霉属，和“Cpa”代表近平滑念珠菌。在一种实施方式中，第二个多重核酸反应液包括以下用于检测光滑念珠菌、检测热带念珠菌和检测耶氏肺孢子菌的引物和探针，检测光滑念珠菌的引物是SEQIDNo：22-27，探针是SEQIDNo：28所示；检测热带念珠菌的引物是SEQIDNo：29-34，探针是SEQIDNo：35；和检测耶氏肺孢子菌的引物是SEQIDNo：36-41，探针是SEQIDNo：42，，其中“Cg”代表光滑念珠菌，“Ctr”代表热带念珠菌，和“PJ”代表耶氏肺孢子菌。在一种实施方式中，第三个多重核酸反应液包括以下用于检测毛霉属和检测克柔念珠菌的引物和探针，检测毛霉属的引物是SEQIDNo：43-48，探针是SEQIDNo：49所示；检测克柔念珠菌的引物是SEQIDNo：50-55，探针是SEQIDNo：56，，其中“Muc”代表毛霉属，和“Kr”代表克柔念珠菌。在一种实施方式中，荧光报告基团可分别为FAM、VIC、HEX、ROX、TexasRed、CY3、CY5中的任一种，所述淬灭基团是BHQ1、BHQ2、BHQ3中任一种。在现有技术中，由于每个靶标恒温扩增都设计六条引物和一个探针，由于引物多，在现实检测中实现多重恒温扩增存在着巨大的困难，对引物和探针的要求特别高。而在本专利技术中，将8种真菌病原体在本专利技术优化设计的引物和探针情况下，确定了8种真菌病原体之间的分组，即，“CA+Asp+Cpa”、“Cg+Ctr+PJ”、“Muc+Kr”分别进行多重等温扩增。在本专利技术多重等温扩增情况下与各自等温单重扩增的情况下都可以实现各自5copies/uL浓度的质粒检测，实现了在本专利技术三组反应液中每组反应液中多个真菌病原体检测中没有互相影响，从而在核酸恒温扩增方法中进行单管多重检测，并且多重检测的灵敏度与特异性达到单重扩增时的技术效果。另外，在本专利技术中实现多重检测的灵敏度与特异性达到单重扩增的灵敏度与特异性，是本专利技术的引物和探针共同作用的结果，在本专利技术中相同多重检测引物的情况下，专利技术人尝试了使用了非RNA碱基的探针或者减少每个靶标的引物条数，本专利技术中实现多重检测的灵敏度比单重扩增的灵敏度下降了一个数量级。因此，利用本专利技术中提供的核酸检测试剂盒，可实现四个单管多重恒温扩增检测呼吸道感染中的8种频率高发的真菌类病原体，且试剂盒操作简便，可实现床旁检测，整个检测用时在30min以内，能够快速精准地实现待测样本中多种真菌病原的筛查。因此，本专利技术建立一种核酸恒温多重扩增检测呼吸道感染真菌病原体，对于实现患者的快速精准诊断具有重要指导意义。具体实施方式为了使本
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本专利技术作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。恒温扩增缓冲液、MgSO4、BstDNA聚合酶均购于纽英伦生物技术有限公司(NewEnglandBiolabs)，dNTP购于宝生物工程(大连)有限公司，RNaseH购于美国IDT公司，所用引物、探针、合成基因均由上海生物工程技术服务有限公司合成。质粒小提试剂盒与真菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。实施例一.呼吸道感染8种真菌病原体核酸多重检测的引物探针组合的确定1.单重引物与探针的设计本专利技术对白色念珠菌(CA)、近平滑念珠菌(Cpa)、光滑念珠菌(Cg)、热带念珠菌(Ctr)、克柔念珠菌(Kr)、曲霉属(Asp)、毛霉属(Muc)、耶氏肺孢子菌(PJ)等真菌病原体基因序列进行分析，在引物探针设计基本原则的基础上利用设计软件进行设计，针对每个病原体靶标进行了引物与探针组合的筛选，每个病原体靶标被筛选的引物探针组合如表1所示。表1.8种真菌病原体被筛选的引物探针组合2.单重引物与探针的筛选2.1单重反应液体系如下表2所示：表2.单重反应液试剂成份组成表反应试剂终物质的量浓度或者终酶活单位本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶切探针恒温检测呼吸道感染真菌病原体的试剂盒，其特征在于，将8个病原体靶标各自引物探针组合成三个多重核酸反应液，第一个多重核酸反应液包括用于检测白色念珠菌、检测曲霉属和检测近平滑念珠菌的引物和探针；第二个多重核酸反应液包括用于检测光滑念珠菌、检测热带念珠菌和检测耶氏肺孢子菌的引物和探针；第三个多重核酸反应液包括用于检测毛霉属和检测克柔念珠菌的引物和探针；/n检测每一个真菌病原体的探针均是含有一个RNA碱基的探针和包括6条恒温扩增引物，所述探针荧光报告基团标记在RNA碱基的按5’-3’方向的左侧，荧光淬灭基团标记在RNA碱基的按5’-3’方向右侧；每个多重核酸反应液内检测每一个真菌病原体的探针标记不同的荧光基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种酶切探针恒温检测呼吸道感染真菌病原体的试剂盒，其特征在于，将8个病原体靶标各自引物探针组合成三个多重核酸反应液，第一个多重核酸反应液包括用于检测白色念珠菌、检测曲霉属和检测近平滑念珠菌的引物和探针；第二个多重核酸反应液包括用于检测光滑念珠菌、检测热带念珠菌和检测耶氏肺孢子菌的引物和探针；第三个多重核酸反应液包括用于检测毛霉属和检测克柔念珠菌的引物和探针；
检测每一个真菌病原体的探针均是含有一个RNA碱基的探针和包括6条恒温扩增引物，所述探针荧光报告基团标记在RNA碱基的按5’-3’方向的左侧，荧光淬灭基团标记在RNA碱基的按5’-3’方向右侧；每个多重核酸反应液内检测每一个真菌病原体的探针标记不同的荧光基团。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，第一个多重核酸反应液包括以下用于检测白色念珠菌、检测曲霉属和检测近平滑念珠菌的引物和探针，检测白色念珠菌的引物是SEQIDNo：1-6，探针是SEQIDNo：7所示；检测曲霉属的引物是SEQIDNo：8-13，探针是SEQIDNo：14；和检测近平滑念珠菌的引物是SEQIDNo：15-20，探针是SEQIDNo：21，






其中“CA”代表白色念珠菌，“Asp”代表曲霉属，和“Cpa”代表近平滑念珠...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凯飞，解立新，刘利成，王华贵，蔡金玉，唐奇，陶毅，冯华华，王鹏志，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，北京宏微特斯生物科技有限公司，江苏宏微特斯医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11