一种基于多重PCR技术和DNB技术的STR分型方法技术

本发明专利技术公开了一种基于多重PCR技术和DNB技术的STR分型方法，包括S1.提取待测样品DNA；S2.针对所选取的STR位点设计多重PCR引物并建立关于DNB环化中STR序列交叉互连的评估体系；S3.以步骤S1待测样本DNA为模板，利用步骤S2设计的多重PCR引物进行第一轮PCR扩增反应；S4.将第一轮PCR产物纯化，进行第二轮PCR扩增引入高通量Index；S5.将第二轮PCR扩增回收、纯化；S6.PCR产物进行DNB测序。本发明专利技术提供了通过一套适用于DNB测序和环化的STR序列交叉互连一整套评估体系，成功建立了基于多重PCR技术和DNB技术的STR分型方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于多重PCR技术和DNB技术的STR分型方法
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种基于多重PCR技术和DNB技术的STR分型方法。
技术介绍
短片段重复序列(shorttandemrepeat，STR)分型技术是目前国内外法医学进行个体识别和亲子鉴定的主要手段，具有简单快速、结果可靠、灵敏度高、重复性好的特点。常染色体STR、Y-STR和X-STR等多种遗传标记的联用对于二联体亲缘鉴定及更复杂的亲缘鉴定具有独特的应用价值。当前法医STR分型检测方法主要为PCR-毛细管电泳法。该方法的主要原理为：①提取DNA，使用磁珠、酚/氯仿、Chelex等方法提取出纯度高、完整性好、浓度适当的DNA样品；②进行PCR扩增，PCR(聚合酶链式反应)技术是以待扩增的两条DNA链为模板，在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下，通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用，快速特异地扩增出目的DNA片段；③毛细管电泳，是以Sanger酶法为原理，采用耐热DNA聚合酶参照待测模板生成一系列链终止片段。在此过程中，以4种不同的荧光染料标记反应产物，并将反应产物经过毛细管电泳分离，采用固定的激光光源对荧光信号进行激发，通过CCD(电荷耦合器件)检测收集数据，计算机分析处理得到序列信息的过程。④确定样品的STR分型。电泳后对荧光颜色不同的DNA片段的峰进行长度检测，将DNA片段与内标进行比较确定其长度，并对应不同的颜色，最后与以同样方式确定的等位基因Ladder进行比较，得到样品的STR分型。目前基于传统的PCR-毛细管电泳的STR技术主要缺点为，一是同时检测的法医位点少，通量低，虽然多色荧光系统的升级推动了一次性检测位点数的增加，但是目前仍然难以超过60个，与此同时法医学需求检测的常染色体STR、YSTR和XSTR的数目逐年增加。二是获得序列信息的完整性有限。基于一代CE技术的传统STR分型法，只能获得扩增子的相对长度信息，无法获得STR重复区和侧翼区的完整碱基序列，未能充分考虑序列可能存在的变异及对测序结果的影响，限制了法医DNA检测的应用场景。高通量测序技术(High-throughputsequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencingtechnology)，该技术可以对数百万个DNA分子进行同时测序，这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，堪称测序技术发展历程的一个里程碑。专利CN102943111A公开了高通量DNA测序法用于测定人类基因组中短片段串联重复基因座的用途及方法，专利CN104673907A公开了一种用于高通量检验STR分型的系统及其检测方法，但是上述基于传统高通量测序技术的STR分型方法的准确性依然有待提高。DNB测序技术基于现有二代测序开发的新的测序技术，基因组DNA首先经过片段化处理，再加上接头序列，并环化形成单链环状DNA，随后使用的滚环扩增技术(Rollingcircleamplification，RCA)可将单链环状DNA扩增2-3个数量级，所产生的扩增产物称为DNA纳米球(DNAnanoball，DNB)，最终纳米球经过DNB装载技术固定在阵列化的硅芯片上。与其他二代测序技术相比较，DNB测序技术具有以下几个优势：(1)DNB通过增加待测DNA的拷贝数而增强了信号强度，从而提高测序准确度；(2)不同于PCR指数扩增，滚环扩增技术的扩增错误不会累积；(3)DNB与芯片上活化位点的大小相同，每个位点只固定一个DNB，保证信号点之间不产生相互干扰；(4)阵列化测序芯片和DNB测序技术的结合，使得成像系统像素和测序芯片的面积得到最大化利用。目前，现有技术中，还未见有基于多重PCR技术和DNB技术的STR分型方法。由于常规的DNB测序方法形成单链环状DNA后，后续接着进行DNB的生成的测序，这一步对于基因组的随机片段或者没有固定结构的普通序列来说，影响不大。但对于存在高度重复结构、多种重复类型、碱基比例普遍失衡的STR序列而言，环化后DNB的生成和扩增可能产生严重的偏向性，甚至单链DNA本身就无法正常环化，进而严重影响测序结果的平衡。因此如何基于STR序列的特点，使用重PCR技术和DNB技术进行STR分型，是目前亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于多重PCR技术和DNB技术的STR分型方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种基于多重PCR技术和DNB技术的STR分型方法，包括如下步骤：S1.待测样品预处理，提取待测样品DNA；S2.针对待测STR基因座设计多重PCR引物并建立关于DNB环化中STR序列交叉互连的评估体系，调整多重PCR引物扩增方向；S3.以步骤S1待测样品DNA为模板，利用步骤S2设计的多重PCR引物进行第一轮PCR扩增反应；S4.将第一轮PCR产物纯化，进行第二轮PCR扩增引入高通量Index；S5.将第二轮PCR扩增回收、纯化；S6.PCR产物进行DNB测序；步骤S2所述评估体系为对任意两条长度分别为m、n的扩增产物序列，在每个可能的碱基配对状态上，逐一移位进行相互比对，计算互连得分，即匹配碱基数和不匹配碱基数的差值；产生(m*n)次碱基比对和(m+n-1)次互连得分，取其中的最高得分作为m、n两条序列的最终互连得分；对于一组包含p条不同序列的集合，自身和两两比较，产生1/2(p2+p)组比较结果；根据比较结果选择一套使得体系互连反应总得分最低的重复基序类型组合，并据此调整所有引物扩增方向，以保证扩增出的STR序列间不发生严重的交叉互连。本专利技术采用多重PCR技术可在一个反应体系内同时检测多个不同的STR基因座，针对STR基因座存在高度重复结构、多种重复类型、碱基比例普遍失衡，环化后DNB的生成和扩增可能产生严重的偏向性，甚至单链DNA本身就无法正常环化的问题，本专利技术设计了一套适用于DNB测序和环化的STR序列交叉互连一整套评估体系，对于需要进行环化的一组STR目标序列(包括所有序列本身、正向和反向序列以及序列和序列之间)都进行严格的序列互补自连评估，从而调整出一套最优的序列方向组合，尽量保证STR序列间不发生严重的交叉互连反应。优选地，所述待测STR基因座包括D1S1656、D2S1338、D2S441、TPOX、D3S1358、FGA、CSF1PO、D5S818、D7S820、D8S1179、D10S1248、TH01、D12S391、vWA、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11或D22S1045中至少两个。优选地，本专利技术在针对STR基因座位点进行引物设计时，除了遵循传统多重PCR引物设计原则，本专利技术还兼顾不同长度、类型和拷贝数STR位点扩增子间的均衡性，使得设计的PCR扩增引物能够精确涵盖用于STR长度计算的核心重复区，并且可根据二代测序序列起始质量较高的特点，通过调整STR重复区的起始位置，以达到最优的测序质量。...

【技术保护点】
1.一种基于多重PCR技术和DNB技术的STR分型方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1.待测样品预处理，提取待测样品DNA；/nS2.针对待测STR基因座设计多重PCR引物并建立关于DNB环化中STR序列交叉互连的评估体系，调整多重PCR引物扩增方向；/nS3.以步骤S1待测样品DNA为模板，利用步骤S2设计的多重PCR引物进行第一轮PCR扩增反应；/nS4.将第一轮PCR产物纯化，进行第二轮PCR扩增引入高通量Index；/nS5.将第二轮PCR扩增回收、纯化；/nS6.PCR产物进行DNB测序；/n步骤S2所述评估体系为对任意两条长度分别为m、n的扩增产物序列，在每个可能的碱基配对状态上，逐一移位进行相互比对，计算互连得分，即匹配碱基数和不匹配碱基数的差值；产生(m*n)次碱基比对和(m+n-1)次互连得分，取其中的最高得分作为m、n两条序列的最终互连得分；对于一组包含p条不同序列的集合，自身和两两比较，产生1/2(p

【技术特征摘要】
1.一种基于多重PCR技术和DNB技术的STR分型方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.待测样品预处理，提取待测样品DNA；
S2.针对待测STR基因座设计多重PCR引物并建立关于DNB环化中STR序列交叉互连的评估体系，调整多重PCR引物扩增方向；
S3.以步骤S1待测样品DNA为模板，利用步骤S2设计的多重PCR引物进行第一轮PCR扩增反应；
S4.将第一轮PCR产物纯化，进行第二轮PCR扩增引入高通量Index；
S5.将第二轮PCR扩增回收、纯化；
S6.PCR产物进行DNB测序；
步骤S2所述评估体系为对任意两条长度分别为m、n的扩增产物序列，在每个可能的碱基配对状态上，逐一移位进行相互比对，计算互连得分，即匹配碱基数和不匹配碱基数的差值；产生(m*n)次碱基比对和(m+n-1)次互连得分，取其中的最高得分作为m、n两条序列的最终互连得分；对于一组包含p条不同序列的集合，自身和两两比较，产生1/2(p2+p)组比较结果；根据比较结果选择一套使得体系互连反应总得分最低的重复基序类型组合，并据此调整所有引物扩增方向，以保证扩增出的STR序列间不发生严重的交叉互连。


2.根据权利要求1所述的STR分型方法，其特征在于，所述待测STR基因座包括D1S1656、D2S1338、D2S441、TPOX、D3S1358、FGA、CSF1PO、D5S818、D7S820、D8S1179、D10S1248、TH01、D12S391、vWA、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11或D22S1045中的至少两个。


3.根据权利要求1所述的STR分型方法，其特征在于，所述多重PCR引物除了遵循传统多重PCR引物设计原则，还兼顾不同长度、类型和拷贝数ST...

【专利技术属性】
技术研发人员：文少卿，雷波，王凌翔，刘超，刘长晖，刘宏，韩晓龙，徐曲毅，
申请(专利权)人：广州深晓基因科技有限公司，广州市刑事科学技术研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44