数字PCR定量检测PML-RARA融合基因的试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了数字PCR定量检测PML‑RARA融合基因的试剂盒及方法，具体地本发明专利技术开发了一种基于数字PCR平台，定量检测急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)中PML‑RARA融合基因长型(L型、bcr1)和短型(S型、bcr3)mRNA的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒，实验结果表明本发明专利技术的检测体系具有极高的灵敏度和准确性。

【技术实现步骤摘要】
数字PCR定量检测PML-RARA融合基因的试剂盒及方法
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及利用数字PCR定量检测PML-RARA融合基因的试剂盒及方法。
技术介绍
急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，APL)是一种特殊类型的急性髓系白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)，占同期AML的10％-15％，发病率约0.23/10万。APL临床表现凶险，起病及诱导治疗中易发生出血和栓塞而引起死亡。近三十年来，由于全反式维甲酸(ATRA)及砷剂的规范化临床应用，APL已成为基本不用进行造血干细胞移植即可治愈的白血病。目前，APL的病因尚不明确，但随着分子生物学、细胞遗传学等学科的快速发展，人们对APL的分子生物学发病机制有了较深的了解。98％以上的APL患者具有特异性染色体易位t(15；17)(q22；q21)，易位的结果导致15号染色体上的早幼粒细胞白血病基因(PML)和17号染色体上的视黄酸受体α(RARα)形成PML-RARA融合基因，其蛋白产物导致细胞分化阻滞和凋亡不足，是APL发生的主要分子机制。由于PML基因的断裂点不同，产生不同长度的PML-RARA融合基因转录本，最终可产生3种不同的PML-RARA融合基因的异构体，分别为长型(L型，bcr1)，变异型(V型，bcr2)和短型(S型，bcr3)，其中长型的发生率约占55％，短型约占45％，变异型约占5％。通过检测PML-RARA融合基因是诊断APL的最特异、敏感的方法之一，也是APL治疗方案选择、疗效分析、预后和复发预测最可靠的指标。目前PML-RARA融合基因常用的检测包括荧光原位杂交(FISH)、免疫分型、实时定量PCR技术(RQ-PCR)和数字PCR等检测方法。(1)荧光原位杂交(FISH检测)，利用携带荧光标记的核酸探针与被检样本中的靶核酸序列进行杂交，在荧光显微镜下直接分析杂交靶序列的彩色探针信号，从而获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息。虽然通过FISH法可根据染色体易位断裂点设计的特异性探针，特异性较好，灵敏度较高，但由于FISH检测的实验操作复杂，对操作人员要求较高，且仅能进行定性检测。(2)免疫分型技术常采用流式细胞仪(FCM)对特异抗原进行检测，利用荧光素标记单克隆抗体(McAb)作为分子探针，多参数分析白血病细胞的胞膜和胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被检测白血病细胞所属细胞学系及分化程度。采用FCM检测微量残留白血病，依赖于肿瘤细胞异常的免疫表型，包括表达交叉系列抗原、抗原表达不同步、抗原表达水平改变等，虽然可对白血病进行定量监测，但因在治疗过程中，白血病细胞免疫表型会产生变化，常需采用两个免疫表型对患者微量残留白血病。FCM法需要特殊仪器，操作技术要求较高，价格昂贵，检测结果重复性不佳。(3)实时荧光定量PCR技术(RQ-PCR)，基于Taqman探针荧光定量PCR，Taqman探针5’端标记一个荧光分子，3’端标记一个荧光淬灭分子。当探针完整时，两者发生荧光共振能量传递(FRET)。PCR扩增时，由于Taq酶5’→3’外切酶活性，将探针水解，使荧光分子和淬灭分子间距增大，荧光监视系统检测到荧光信号。该方法操作相对较为简单，但定量检测时依赖于标准曲线，定量准确性差，灵敏度不佳。(4)数字PCR技术在不于依赖标准曲线的情况下可对核酸分子进行绝对定量，在检测PML-RARA融合基因时具有较高的灵敏度和特异性。其技术原理为在传统的PCR扩增前对样品进行分割，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微反应，其中每个微反应或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，对微反应进行检测，有荧光信号的微反应判读为1，没有荧光信号的微反应判读为0，根据泊松分布原理及阳性微反应的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，数字PCR无需标准曲线，可对低拷贝待检靶分子进行绝对定量。数字PCR可通过对核酸精确定量，对肿瘤进行诊断、监测，以指导个体化治疗。中国急性早幼粒细胞白血病诊疗指南指出(2018年版)，检测PML-RARA融合基因是诊断APL的最特异最敏感生物方法之一，对PML-RARA融合基因表达水平进行定量检测也是APL治疗方案选择、疗效分析、预后分析和复发预测最可靠的指标，从而更好的指导患者分子靶向治疗和预后判断。综上所述，现阶段临床亟需一种灵敏度高，特异性好，同时能快速可靠地对PML-RARA融合基因mRNA的表达水平进行定量检测的方法及试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种基于数字PCR平台，定量检测急性早幼粒细胞白血病(APL)中PML-RARA长型融合基因(bcr1)和PML-RARA短型融合基因(bcr3)mRNA的表达水平的的方法、引物、探针及其试剂盒。具有实验过程简单、绝对定量、引探用量低等优点。在本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测PML-RARA融合基因的引物对集，所述引物对集包括：第一引物对，所述第一引物对包括如SEQIDNO.:1所示的正向引物，和/或如SEQIDNO.:2所示的正向引物；以及，如SEQIDNO.:3所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对集还包括：第二引物对，所述第二引物对组包括如SEQIDNO.:4所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:5所示的反向引物。本专利技术的第二方面，提供了一种检测PML-RARA融合基因的探针集，所述探针集包括：SEQIDNO.6所示的第一探针。在另一优选例中，所述探针集还包括：SEQIDNO.7所示的第二探针。在另一优选例中，所述第一探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第一探针的3’端包含有荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述第二探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第二探针的3’端包含有荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述第一探针标记的荧光报告基团不同于所述第二探针标记的荧光报告基团。本专利技术的第三方面，提供了一种用于检测PML-RARA融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术第一方面所述的引物对集。在另一优选例中，所述试剂盒还包括本专利技术第二方面所述的探针集。在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQIDNO：1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4、SEQIDNO.:5、SEQIDNO.:6、和SEQIDNO.:7所示的多核苷酸序列。在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内包含ddPCR预混液；优选地，所述ddPCR预混液包含选自下组的一种或多种组分：dNTP混合物、热启动Taq酶、RNase抑制剂。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性对照。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性对照。优选地，所述阴性对照为纯水。...

【技术保护点】
1.一种用于检测PML-RARA融合基因的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：/n第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物，和/或如SEQ IDNO.:2所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.:3所示的反向引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测PML-RARA融合基因的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括如SEQIDNO.:1所示的正向引物，和/或如SEQIDNO.:2所示的正向引物；以及，如SEQIDNO.:3所示的反向引物。


2.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：
第二引物对，所述第二引物对组包括如SEQIDNO.:4所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:5所示的反向引物。


3.一种检测PML-RARA融合基因的探针集，其特征在于，所述探针集包括：SEQIDNO.6所示的第一探针；
优选地，所述探针集还包括：SEQIDNO.7所示的第二探针。


4.一种用于检测PML-RARA融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对集。


5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求3所述的探针集。


6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，朱小亚，王丽芳，徐小解，黄志文，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44