一种RNA融合基因检测方法和试剂盒技术

一种RNA融合基因检测方法和试剂盒，其中该方法包括：提供待检测RNA样本反转录成的cDNA以及融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物；使用融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物分别对cDNA的融合基因断点区域和内参基因进行PCR扩增，以得到融合基因断点区域和内参基因扩增子；对融合基因断点区域和内参基因扩增子进行测序，并统计测序结果中覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数；计算覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数之间的比例；根据该比例确定基因融合的发生。本发明专利技术具有对样本质量和投入量要求低、操作简便、建库速度快、成本低等优势，可以快速对组织样本的多个融合基因进行检测。

【技术实现步骤摘要】
一种RNA融合基因检测方法和试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，具体涉及一种RNA融合基因检测方法和试剂盒。
技术介绍
融合基因是由染色体的易位、插入、颠倒、缺失等重排导致的。融合基因引发癌症的机制主要有两种：一部分发生在肿瘤驱动基因上的基因融合使这些基因拥有强的启动子或增强子，或激活转录因子，使其异常表达；另一部分融合基因会产生有生物学作用(如激酶活性等)的嵌合体蛋白，使生物体紊乱。可用药的激酶融合在检测的单个癌症类型中检测到的频率为1％-9％，包括ALK、ROS1、RET、NTRKs和FGFR等。目前针对融合基因的肿瘤靶向药物已有多种获得FDA/CFDA批准，如针对ALK、ROS1基因融合的克唑替尼，以及针对NTRKs基因融合的Larotrectinib等。美国国家综合癌症网络(NCCN)指出，含有融合基因的患者可接受相应的靶向药物治疗，推荐的检测手段有高通量测序(NGS)、实时荧光定量PCR(RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)，以及免疫组化(IHC)等。由于FISH和IHC等方法具有通量低、检测周期长、费用昂贵等缺点，而RT-PCR只能用来检测已知融合变异，NGS技术被越来越多用在肿瘤基因融合的检测上。在目前已报道的近10000个基因融合中，有90％是通过NGS方法鉴定的。由于融合多发生在内含子区域且断点位置不固定，RNA测序也被广泛用来进行融合基因的检测。RNA测序有基于PCR和杂交捕获(RNA-Capseq)两种靶向测序方法。由于RNA-Capseq具有操作复杂、成本高、需要的样本投入量大等缺点，基于多重PCR的RNA融合基因检测方法也被多家公司采用进行相应的检测。
技术实现思路
本专利技术提供一种RNA融合基因检测方法和试剂盒，具有对样本质量和投入量要求低、操作简便、建库速度快、成本低等优势，可以快速对组织样本的多个融合基因进行检测。根据第一方面，一种实施例中提供一种RNA融合基因检测方法，包括：提供待检测RNA样本反转录成的cDNA以及融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物，其中融合基因断点区域的扩增引物中的上、下游引物分别设计在融合断点两侧的驱动基因和与上述驱动基因融合的另一基因的转录区域中，使得融合发生时能够扩增出上述融合基因断点区域而融合未发生时不能扩增出上述融合基因断点区域；使用上述融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物分别对上述cDNA的融合基因断点区域和内参基因进行PCR扩增，以得到融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子；对上述融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子进行测序，并统计测序结果中覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数；计算上述覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数之间的比例或对上述扩增子读长数进行均一化处理得到均一化结果；根据上述比例或上述均一化结果，确定上述RNA样本是否在上述驱动基因和上述另一基因间发生融合。在优选实施例中，上述PCR扩增为包括第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的多重PCR扩增；相应地，上述扩增引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物。在优选实施例中，上述内参基因为管家基因。在优选实施例中，上述管家基因选自RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因中的一种或多种。在优选实施例中，上述内参基因的扩增引物为RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因的引物的混合物；相应地，上述测序结果中内参基因的扩增子读长数为RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因的扩增子读长数的平均值。在优选实施例中，上述内参基因可能包含RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP以外的其他管家基因。在优选实施例中，上述驱动基因选自ALK、ROS1、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、NTRK1、NTRK2、NTRK3、BRAF、FLI1、MET、ERG和NRG1基因中的一种或多种。在优选实施例中，上述方法还包括：在上述驱动基因的远离融合基因断点位置的5’端和3’端各设计一对引物，并使用该对引物对上述cDNA进行PCR扩增，以得到上述5’端和3’端的读长数，并根据该读长数的相对变化对融合基因的判定结果进行进一步确认。在优选实施例中，上述方法还包括：将待检测RNA样本反转录成cDNA，以用作上述PCR扩增的模板。在优选实施例中，上述方法还包括：在上述扩增子的两端加上测序接头，以适配后续测序中的高通量测序平台。在优选实施例中，上述方法还包括：对上述扩增子进行单链环化，以适应后续的MGI测序平台的高通量测序。根据第二方面，一种实施例中提供一种RNA融合基因检测试剂盒，包括：融合基因断点区域的扩增引物，其包括上、下游引物，分别设计在融合断点两侧的驱动基因和与上述驱动基因融合的另一基因的转录区域中，使得融合发生时能够扩增出上述融合基因断点区域而融合未发生时不能扩增出上述融合基因断点区域；内参基因的扩增引物，其包括扩增内参基因上的序列片段的引物对；上述融合基因断点区域的扩增引物和上述内参基因的扩增引物，用于分别对cDNA的融合基因断点区域和内参基因进行PCR扩增，以得到融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子，并进一步测序得到测序结果中覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数，以用于计算上述覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数之间的比例或对上述扩增子读长数进行均一化处理得到均一化结果，并根据上述比例或上述均一化结果，确定上述RNA样本是否在上述驱动基因和上述另一基因间发生融合。本专利技术通过PCR扩增融合基因断点区域和内参基因获得相应的扩增子，通过测序得到扩增子读长数，并通过对扩增子读长数的统计和分析得到基因融合的发生情况。本专利技术可快速制备用于检测RNA样本中多个融合基因的高通量测序文库。从得到RNA样本到建库完成一共只需要6个小时，其中手工操作的时间约为2个小时。下机数据基于序列比对，简便快速，可自动化程度高。相比锚定PCR和RNA-Capseq，本专利技术需要更短的建库和信息分析时间，需要的测序数据量小于0.5M/样本。由于步骤简单、操作方便、时间缩短、测序数据需求量小，相应的成本也会降低。附图说明图1为本专利技术实施例中融合基因检测的设计原理示意图，融合扩增子的引物设计在融合断点的两侧，驱动基因的5’端和3’端也设计有引物；图2为本专利技术实施例中所建文库的电泳结果图，其中最左侧为DNAmarker，文库主峰在250-300bp之间。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RNA融合基因检测方法，其特征在于，所述方法包括：/n提供待检测RNA样本反转录成的cDNA以及融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物，其中融合基因断点区域的扩增引物中的上、下游引物分别设计在融合断点两侧的驱动基因和与所述驱动基因融合的另一基因的转录区域中，使得融合发生时能够扩增出所述融合基因断点区域而融合未发生时不能扩增出所述融合基因断点区域；/n使用所述融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物分别对所述cDNA的融合基因断点区域和内参基因进行PCR扩增，以得到融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子；/n对所述融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子进行测序，并统计测序结果中覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数；/n计算所述覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数之间的比例或对所述扩增子读长数进行均一化处理得到均一化结果；/n根据所述比例或所述均一化结果，确定所述RNA样本是否在所述驱动基因和所述另一基因间发生融合。/n

【技术特征摘要】
1.一种RNA融合基因检测方法，其特征在于，所述方法包括：
提供待检测RNA样本反转录成的cDNA以及融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物，其中融合基因断点区域的扩增引物中的上、下游引物分别设计在融合断点两侧的驱动基因和与所述驱动基因融合的另一基因的转录区域中，使得融合发生时能够扩增出所述融合基因断点区域而融合未发生时不能扩增出所述融合基因断点区域；
使用所述融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物分别对所述cDNA的融合基因断点区域和内参基因进行PCR扩增，以得到融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子；
对所述融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子进行测序，并统计测序结果中覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数；
计算所述覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数之间的比例或对所述扩增子读长数进行均一化处理得到均一化结果；
根据所述比例或所述均一化结果，确定所述RNA样本是否在所述驱动基因和所述另一基因间发生融合。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增为包括第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的多重PCR扩增；相应地，所述扩增引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内参基因为管家基因。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述管家基因选自RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因中的一种或多种。


5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述内参基因的扩增引物为RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因的引物的混合物；相应地，所述测序结果中内参基因的扩增子读长数为RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因的扩增子读长数的平均值。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述驱...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿荷芳，黎美燕，吕硕，梅智颖，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44