检测可用于指导卡马西平用药的HLA-B*1502分型的引物和方法技术

本发明专利技术公开了检测HLA‑B*1502分型的引物和方法，所述引物包括特异性扩增HLA‑B*1502分型序列的正、反向引物、内参引物和测序引物；结合Sanger测序技术，快速准确地检测HLA‑B*1502分型，可用于指导卡马西平用药。

【技术实现步骤摘要】
检测可用于指导卡马西平用药的HLA-B*1502分型的引物和方法
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测可用于指导卡马西平用药的HLA-B*1502分型的引物和方法，采用普通PCR结合Sanger测序技术。
技术介绍
卡马西平是临床上常用的抗癫痫药，其临床应用较为广泛，也是三叉神经痛、舌咽神经痛、躁狂抑郁症等疾病的常用药物。多年来的研究表明，卡马西平(CBZ)等芳香族抗癫痫药物可引起药疹，约10％的药疹是由卡马西平引起，包括非大疱型皮肤不良反应斑丘疹(MPE)和超敏综合征(HSS)，以及大疱型皮肤不良反应Steven-Johnson综合征(SJS)、中毒性表坏死松解征(TEN)。其中SJS、TEN为重型药疹，可危及生命，死亡率高达30％以上。卡马西平因为引起药疹甚至重症药疹而引起人们关注，而SJS、TEN等致死性不良反应的发生与患者的HLA-B*1502基因存在一定相关性，其与HLA-B*1502的相关性在中国台湾地区的汉族人群首次得到证实。有分析进一步表明在汉族人群、东南亚国家HLA-B*1502与SJS/TEN显著相关。美国FDA已批准在卡马西平药品说明书中增加汉族及东南亚裔人群在服用卡马西平前进行HLA-B*1502等位基因筛查的建议，HLA-B*1502阳性的个体应慎用卡马西平，以避免出现严重的皮肤毒性反应；我国国家卫生健康委临床检验中心相关文件《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》中也明确指出，“携带HLA-B*1502等位基因者慎用卡马西平和苯妥英，以免引起SJS/TEN”。据报道，中国人群中携带人白细胞抗原HLA-B*1502等位基因的人群比例为4％-22％。因此在患者选择卡马西平进行治疗前，对HLA-B*1502基因分型进行检测十分必要，可为临床安全用药提供实验依据。HLA目前的分型方法主要有3类：血清学、细胞学和分子生物学分型法。其中血清学和细胞学分型法，由于高特异性的抗体和特异的细胞获取困难，且操作繁琐，因此目前很少使用。随着分子生物学技术的发展，建立在DNA分子水平上的快速准确的HLA基因分型已逐步取代传统的血清学分型方法。分子生物学分型方法主要有聚合酶链反应-等位基因组特异性引物(PCR-SSP)、聚合酶链反应-序列特异寡核苷酸探针(PCR-SSO)、聚合酶反应-直接测序法(PCR-SBT)。其中PCR-SBT可以直接对HLA基因型的序列进行测定，分辨率高，能直接发现新的等位基因，但是由于杂合子的存在，需将同源染色体分离后才能得到各个单元型的准确结果，增加了操作的复杂性，检测成本也相应较高；PCR-SSP和PCR-SSO属于低分辨HLA分型方法，其中PCR-SSP(序列特异性引物PCR)是临床和基础研究中应用较多的HLA基因分型方法，其分型的原理是根据HLA各等位基因的核苷酸序列，设计一套针对每一等位基因特异性的或组特异性的引物，通过PCR特异性扩增该基因片段，从而达到分析HLA多态性的目的。与其他HLA基因分型方法进行相比，PCR-SSP避免了杂交、酶切等步骤，特别是具有简便省时、所需样本量少、对血液质量要求不严、特异性高、技术条件易掌握等特点，结果直观，便于分析，是最先应用于临床的HLA基因分型技术。综上所述，本研究运用PCR-SSP配合基因测序的方法进行HLA-B*1502基因分型检测，为临床安全用药提供实验依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测可用于指导卡马西平用药的HLA-B*1502分型的引物和方法，采用普通PCR结合Sanger测序技术，可快速准确的检测患者体内HLA-B*1502基因分型，为卡马西平用药提供指导。所述检测HLA-B*1502分型的引物，包括：特异性扩增HLA-B*1502分型的引物，其碱基序列为：HLA-B*1502-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGAACACACAGATCTCCAAGACCAHLA-B*1502-R：AACAGCTATGACCATGCAGCCATACATCCTCTGGATGA。进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG进一步地，还包括检测内参基因的引物actin-F和actin-R，其碱基序列为：actin-F：CTAACTGCGCGTGCGTTCTactin-R：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG。进一步地，所述正、反向引物在体系内的浓度均为0.1875uM。进一步地，所述内参基因的引物的使用浓度比为：actin-F:actin-R＝1:1。本专利技术还提供了一种检测指导卡马西平用药的HLAB1502分型的方法，包括以下步骤：1.抽提外周血或骨髓中的基因组DNA；2.利用扩增引物HLA-B*1502-F/HLA-B*1502-R和actin-F/actin-R对步骤1中的DNA进行扩增，当内参actin-F/actin-R扩增有目的条带，而HLA-B*1502-F/HLA-B*1502-R扩增无目的条带时，可确定样本HLA-B*1502分型为阴性，当两对引物的扩增都有目的条带时，需对样本进行测序检测；3.利用测序引物M13-F与M13-R对步骤2中的扩增产物进行测序；4.将步骤3中的测序结果与野生型HLA-B*1502等位基因序列进行比较，与HLA-B*1502等位基因序列完全相符，则可确定样本HLA-B*1502分型阳性，否则为阴性；其中PCR扩增引物为：HLA-B*1502-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGAACACACAGATCTCCAAGACCAHLA-B*1502-R：AACAGCTATGACCATGCAGCCATACATCCTCTGGATGA。进一步地，测序引物碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG。进一步地，扩增体系内模板DNA最终浓度为0.25ng/uL以上。本专利技术还提供了一种检测指导卡马西平用药的HLAB1502分型的试剂盒，包括检测特异性扩增HLA-B*1502分型的引物，其碱基序列为：HLA-B*1502-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGAACACACAGATCTCCAAGACCAHLA-B*1502-R：AACAGCTATGACCATGCAGCCATACATCCTCTGGATGA。进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG进一步地，还包括检测内参基因的引物actin-F和actin-R，其碱基序列为：actin-F：CTAACTGCGCGTGCGTTCTactin-R：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG。有益效果：一、本专利技术能过对HLA-B*1502的全部15本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一对检测指导卡马西平用药的HLA-B*1502分型的引物，其特征在于，包括：/n特异性扩增HLA-B*1502分型的引物，其碱基序列为：/nHLA-B*1502-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGAACACACAGATCTCCAAGACCA/nHLA-B*1502-R：AACAGCTATGACCATGCAGCCATACATCCTCTGGATGA。/n

【技术特征摘要】
1.一对检测指导卡马西平用药的HLA-B*1502分型的引物，其特征在于，包括：
特异性扩增HLA-B*1502分型的引物，其碱基序列为：
HLA-B*1502-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGAACACACAGATCTCCAAGACCA
HLA-B*1502-R：AACAGCTATGACCATGCAGCCATACATCCTCTGGATGA。


2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。


3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括检测内参基因的引物actin-F和actin-R，所述检测内参基因的碱基序列为：
actin-F：CTAACTGCGCGTGCGTTCT
actin-R：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG。


4.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正、反向引物在体系内的浓度均为0.1875uM。


5.如权利要求3所述的引物，其特征在于，所述内参基因的引物的使用浓度比为：actin-F:actin-R＝1:1。


6.一种检测指导卡马西平用药的HLAB1502分型的方法，包括以下步骤：
(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪青，王淑一，
申请(专利权)人：福州艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35