检测HLA-B*5701分型的引物和方法技术

技术编号:28021639 阅读:58 留言:0更新日期:2021-04-09 23:00
本发明专利技术公开了检测HLA‑B*5701分型的引物,包括扩增HLA‑B*5701的引物和测序引物;采用聚合酶反应‑直接测序法(PCR‑SBT),可用于快速检测与氟氯西林用药引起的肝损伤相关HLA‑B*5701等位基因。利用本发明专利技术完成的检测结果准确,对氟氯西林的临床用药安全性有重要的参考意义。

【技术实现步骤摘要】
检测HLA-B*5701分型的引物和方法
本专利技术属生命科学和生物
,特别涉及检测HLA-B*5701等位基因的引物,采用聚合酶反应-直接测序法(PCR-SBT),可用于快速检测与氟氯西林用药引起的肝损伤相关的HLA-B*5701分型,可用于指导临床上氟氯西林的用药。
技术介绍
肝脏作为人体的代谢器官之一,绝大部分药物都需要在肝脏进行分解和代谢,因此肝脏也成为了药物及代谢产物攻击的靶器官之一。那么,在使用药物的过程中,由药物自身或其代谢产物引起的毒性损害,或肝脏对药物及代谢产物的过敏反应所致的疾病,称为药物性肝损伤(drug-inducedliverinjury,DILI),亦称为药物性肝病(drug-inducedliverdisease,DILD),是一种严重的药物不良反应,一种复杂疾病。近年来随着各种药物引起肝损伤的病例报道不断增多,DILI已成为一个不容忽视的公共卫生问题。据世界卫生组织(WHO)统计,DILI已上升为全球死亡原因的第5位,直接影响着患者的治疗和康复。在美国,DILI已成为急性肝衰竭的首要病因。在我国DILI形势也日趋严峻,据统计DILI患者已占肝病患者的l%-5%,占急性肝炎患者的10%,占暴发性肝衰竭患者的13%~30%。然而实际中由于DILI临床表现复杂,实验室检查无特异性,其真实发病率常被低估。此外,随着新药物的不断上市,DILI发病率也在不断增高。之前有研究表明,DILI的发生与药物活性代谢产物、代谢酶和转运体活性、胆汁淤积、钙平衡失调、线粒体功能障碍以及氧化应激等因素相关。但是随着研究的不断深入,越来越多的研究表明DILI的发生与个体人类白细胞抗原(humanleucocyteantigen,HLA)等位基因多态性相关。它的多态性是由于同源染色体的相同位置上存在不同形态基因,即等位基因(allele)不同导致的结果。有研究通过候选基因关联研究和全基因组关联分析发现了由于特定药物引起的肝损伤与主要HLA基因位点之间的相关信息(如表1所示)。其中,氟氯西林作为临床上常用的耐青霉素酶抗生素,一直以来都有其引起胆汁淤积性肝炎的报道,并且该不良反应在女性、老年人和长期用药患者中更易发生。有研究发现HLAⅠ类基因B*5701与氟氯西林引起的DILI高度相关,是与DILI关联性最强的等位基因。虽然GWAS数据提示其与氟氯西林引起的DILI高度相关,但由于该不良反应的发生率很低(8.5/10万人),阳性预测值只有0.0012,平均检测13513例患者才能预测出一例DILI。HLA又被称为人类的MHC,是控制细胞间相互识别、调节免疫应答的一组紧密连锁基因群。HLA基因家族位于人类第6号染色体短臂(6p21.31),全长3.6Mb,占人类基因组碱基数的0.1%,是迄今为止最复杂、多态性最丰富、免疫功能相关基因最集中、与疾病关联最密切的一个区域。根据其在染色体上的排列可分为3个区域(如图1所示),HLAⅠ类区位于端粒侧,长度约为2000kb,包括A、B、C三个基因座位,编码产物分别为HLA-A、HLA-B、HLA-C分子的α链(即重链)。HLAI类分子分布于所有的组织细胞上,但表达水平有所不同,是细胞膜上的移植抗原,是引起移植后排斥反应发生的主要抗原。HLAⅡ类区位于着丝粒侧,长度约为1000kb,包括DR、DQ、DP三个区域,每个区域又包含若干个A和B基因,分别编码HLAII类分子(HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP)的α链和β链。HLAII类分子主要分布于免疫细胞上它们可以作为免疫细胞间识别标记而诱发免疫应答和调节免疫细胞间的相互作用,在免疫应答反应中发挥重要作用。而III类基因区位于HLA-I、II类基因区之间,由一些与补体和某些炎症因子编码相关的基因组成。HLA基因编码一组位于细胞表面的多态性蛋白,可结合并提呈抗原肽供T细胞识别,并激活T细胞启动特异性免疫应答,与个体免疫反应差异直接相关。因此,本项目对氟氯西林引起DILI的相关HLA-B*5701基因多态性的研究有助于DILI发生机制的深入探究,提高氟氯西林临床用药安全性,实现个体化治疗,也有利于新药研发中对易引起肝毒性药物进行早期筛选,具有重要的临床应用及经济学价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测HLA-B*5701等位基因的引物,采用PCR-SBT方法,可快速检测与氟氯西林用药引起的肝损伤相关的HLA-B*5701分型。所述检测HLA-B*5701等位基因的引物,包括:扩增HLA-B*5701的引物,其碱基序列为:HLA-B*5701-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAACATGAAGGCCTCCGCGHLA-B*5701-R:AACAGCTATGGCCATACATCACCTGGATGATGTG。进一步地,还包括测序引物,其碱基序列为:M13-F:TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R:AACAGCTATGACCATG。进一步地,还包括检测内参基因的引物,其碱基序列为:actin-F:CTAACTGCGCGTGCGTTCTactin-R:AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG。本专利技术还提供了一种检测HLA-B*5701等位基因的方法,包括以下步骤:检测HLA-B*5701等位基因的方法,包括以下步骤:(1)抽提样本基因组DNA;(2)用扩增HLA-B*5701等位基因的引物HLA-B*5701-F/HLA-B*5701-R,扩增内参基因的引物actin-F/actin-R扩增步骤(1)中提取的DNA;(3)用测序引物M13对步骤(2)中利用HLA-B*5701-F/HLA-B*5701-R扩增的产物进行测序,获得扩增的基因序列;(4)将(3)中获得的基因序列与已知基因库中HLA-B*5701序列进行比对,对测序结果进行判断,确定样本是否为HLA-B*5701分型;其中PCR扩增引物分别为:HLA-B*5701-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAACATGAAGGCCTCCGCGHLA-B*5701-R:AACAGCTATGGCCATACATCACCTGGATGATGTGactin-F:CTAACTGCGCGTGCGTTCTactin-R:AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG。测序引物碱基序列为:M13-F:TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R:AACAGCTATGACCATG。本专利技术还提供了一种检测HLA-B*5701等位基因的试剂盒,所述试剂盒包括:(i)血液DNA抽提试剂;(ii)检测体系PCR扩增反应液:包括扩增HLA-B*5701等位基因的引物和扩增内参基因的引物,其碱基序列分别为:HLA-B*5701-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAACATGAAGGCCTCCGCGHLA-B*5701-R:AACAGCTATGG本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.检测HLA-B*5701等位基因的引物,其特征在于,包括:/n扩增HLA-B*5701的引物,其碱基序列为:/nHLA-B*5701-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAACATGAAGGCCTCCGCG/nHLA-B*5701-R:AACAGCTATGGCCATACATCACCTGGATGATGTG。/n

【技术特征摘要】
1.检测HLA-B*5701等位基因的引物,其特征在于,包括:
扩增HLA-B*5701的引物,其碱基序列为:
HLA-B*5701-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAACATGAAGGCCTCCGCG
HLA-B*5701-R:AACAGCTATGGCCATACATCACCTGGATGATGTG。


2.如权利要求1所述的引物,其特征在于,还包括测序引物,其碱基序列为:
M13-F:TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R:AACAGCTATGACCATG。


3.如权利要求1所述的引物,其特征在于,还包括检测内参基因的引物,其碱基序列为:
actin-F:CTAACTGCGCGTGCGTTCT
actin-R:AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG。


4.检测HLA-B*5701等位基因的方法,包括以下步骤:
(1)抽提样本基因组DNA;
(2)用扩增HLA-B*5701等位基因的引物HLA-B*5701-F/HL...

【专利技术属性】
技术研发人员:董春燕王淑一
申请(专利权)人:合肥艾迪康医学检验实验室有限公司
类型:发明
国别省市:安徽;34

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