检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点的引物和方法技术

本发明专利技术公开了检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567:TA的引物、方法和试剂盒，包括扩增rs72613567位点的引物；采用Sanger测序技术，可用于快速检测慢性肝炎患者体内rs72613567位点突变情况。利用本发明专利技术完成的检测结果准确，可为预防慢性肝炎转化为肝硬化提供风险评估和遗传学指导。

【技术实现步骤摘要】
检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点的引物和方法
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变的引物，采用普通PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测慢性肝炎患者体内HSD17B13基因的rs72613567位点的突变情况。
技术介绍
慢性肝炎是世界范围内的主要疾病之一，导致较高的死亡率。慢性肝炎常见的病因有肝炎病毒(乙肝病毒，丙肝病毒)感染、长期饮酒、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、自身免疫性肝炎等。病程呈波动性或持续进行性，如不进行适当的治疗，部分患者可进展为肝硬化。然而，这种疾病的病程在个体之间有差异，这种差异至少在一定程度上归因于遗传风险因素。近年来，基因因素在慢性肝病进展中的作用已成为肝病学界的主要研究领域之一。最近有研究发现17β-羟基甾体脱氢酶13(HSD17B13)单碱基突变和慢性肝损伤之间的关联。17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSDs)是一类NAD(P)H/NAD(P)依赖的氧化还原酶，因其可以氧化类固醇的第17位碳而得名。在辅助因子NAD(P)H/NAD(P)+的帮助下，17β-HSDs可以通过氧化17-羟或者还原17-酮从而使18碳或者19碳的类固醇活化或者失活。目前在哺乳动物中，该家族已报道有14名成员，根据发现的顺序依次命名为17β-HSD1-14。2007年，上海复旦遗传所的刘等人从人肝脏的cDNA文库克隆出HSD17B13。此酶在肝脏中高表达，在17β-HSD家族的14个成员中，只有HSD17B13和HSD17B11这两个基因的染色体位于4q22.1。该区域富含一类编码视黄醇脱氢酶的基因，因此HSD17B13的染色体定位提示这个酶可能参与视黄醇代谢。一项大规模研究使用外显子序列方法在四个独立的队列中识别HSD17B13变体和慢性肝损伤之间的关联。结果显示，HSD17B13rs72613567与降低酒精性和非酒精性肝病的风险相关，包括慢性肝炎进展为肝硬化和脂肪变性进展为脂肪性肝炎。最近丹麦的一项人口研究也表明，携带HSD17B13rs72613567变异与降低丙氨酸转氨酶(ALT)水平有关，并发现这种降低ALT的效果被脂肪肝和饮酒的遗传风险所放大，提示HSD17B13rs72613567对酒精性肝病和NAFLD有保护作用。有功能研究表明，rs72613567由位于编码基因区域(chr4:87310241,GRCh38.p7)附近的一个腺嘌呤插入(A-ins)组成，该插入位点位于内含子6的供体剪接位点附近，导致HSD17B13蛋白发生帧移位和过早截断，造成酶活性的降低。也有报道HSD17B13基因的rs72613567:TA变异影响肝脏脂质稳态。虽然目前作用机制尚不明确，但HSD17B13蛋白在携带rs72613567A-ins等位基因的患者肝脏中表达明显降低，同时降低了慢性肝病进展为肝硬化的风险。这种有益的效应在减少肝损伤甚至在遗传易感性方面可能成为一个潜在的药物靶标。据文献报道rs72613567:TA在西班牙裔美国人和非洲人(分别为9％和1～8％)中发病率较低，但在东亚人和欧洲人(分别为27～40％和22～31％)中发病率较高。开发检测rs72613567:TA的方法，即可为预防慢性肝炎转化为肝硬化提供风险评估和遗传学指导，也可进一步推动其致病机理的研究和靶向药物的研发。Sanger测序法是基因检测的主要手段之一，也是基因检测的金标准。通过测序法对HSD17B13rs72613567:TA突变进行检测，可为慢性肝炎患者的提供风险评估和遗传学指导。本专利技术中发现HSD17B13基因的rs72613567位点的突变在中国人群中存在较普遍，发生率为44.12％。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测慢性肝炎患者体内HSD17B13基因的rs72613567位点的突变情况。所述检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变情况的引物，包括：扩增HSD17B13基因的rs72613567位点的引物，其碱基序列为：HSD17B13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGGGATGTGGAGGAAGTGHSD17B13-R：AACAGCTATGACCATGCTATTGGTGTTTTAGTATTTGGGT。进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG。引物序列HSD17B13-F和HSD17B13-R是扩增慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567碱基的引物。本专利技术还提供了检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变情况的方法，包括以下步骤：1.抽提外周血或肌肉组织中的基因组DNA；2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；3.对步骤2中的扩增产物进行测序；4.对测序结果进行判断，确定HSD17B13基因的rs72613567位点是否发生突变；其中PCR扩增引物为：扩增HSD17B13基因的rs72613567位点的引物，其碱基序列为：HSD17B13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGGGATGTGGAGGAAGTGHSD17B13-R：AACAGCTATGACCATGCTATTGGTGTTTTAGTATTTGGGT。进一步地，测序引物碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG。本专利技术还提供了一种检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(i)血液/组织DNA抽提试剂；(ii)检测体系PCR扩增反应液：包括扩增HSD17B13基因的rs72613567位点的引物，其碱基序列为：HSD17B13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGGGATGTGGAGGAAGTGHSD17B13-R：AACAGCTATGACCATGCTATTGGTGTTTTAGTATTTGGGT；(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG；(iv)阳性对照品和阴性对照品。有益效果：一、我国现有肝脏病患者总数约为4亿，其中慢性乙肝感染者约9300万人，丙肝约1300万人，慢性肝炎在我国的发病率较高，每年会有大量慢性肝炎患者发展为肝硬化等疾病。rs72613567：TA作为一种有益突变，可减少慢性肝炎发展为肝硬化的风险。本专利技术通过对慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567的突变情况进行检测，可为慢性肝炎患者提供风险评估和遗传学建议，具有很好的经济和社本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变情况的引物，其特征在于，包括：/n扩增HSD17B13基因的rs72613567位点的引物，其碱基序列为：/nHSD17B13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGGGATGTGGAGGAAGTG/nHSD17B13-R：AACAGCTATGACCATGCTATTGGTGTTTTAGTATTTGGGT。/n

【技术特征摘要】
1.检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变情况的引物，其特征在于，包括：
扩增HSD17B13基因的rs72613567位点的引物，其碱基序列为：
HSD17B13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGGGATGTGGAGGAAGTG
HSD17B13-R：AACAGCTATGACCATGCTATTGGTGTTTTAGTATTTGGGT。


2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。


3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列HSD17B13-F和HSD17B13-R是扩增慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567的引物。
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪青，王淑一，
申请(专利权)人：杭州艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33