A型肉毒毒素治疗真皮微血管内皮细胞再灌注损伤处理规范制造技术

本发明专利技术公开了A型肉毒毒素(BTXA)预处理真皮微血管内皮细胞拮抗再灌注的处理过程，利用手术过程中多余的皮肤组织，通过中性蛋白酶和胶原酶进行孵育消化，提取独立的真皮细胞，进行磁珠分选，以获得真皮微血管内皮细胞，进行细胞培养。通过传代培养将细胞分成八组：第一组置于低氧舱(通入低氧混合气体5％O

【技术实现步骤摘要】
A型肉毒毒素治疗真皮微血管内皮细胞再灌注损伤处理规范
本专利技术主要涉及离体细胞实验中将A型肉毒毒素用于真皮微血管内皮细胞的培养，通过这种处理规范，可以减轻真皮微血管内皮细胞的缺血再灌注损伤。
技术介绍
肉毒素是由肉毒梭菌分泌的外毒素，可抑制神经末梢乙酰胆碱释放，松弛肌肉，常用于整形外科的身体塑形等，在临床上运用广泛。目前A型肉毒素较易获取，且近年来有诸多文献报道，A型肉毒素可以直接扩张血管，并且可以激活细胞的自噬，减轻组织器官的缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤过程中，对组织造成损伤的主要因素不是缺血本身，而是恢复血液供应后，重新获得血液供应的组织细胞受到过量自由基的攻击破坏，这种二次损伤被称作“组织缺血再灌注损伤”。缺血再灌注损伤会导致真皮微血管内皮细胞的损伤，甚至导致坏死或凋亡，但目前许多药物或者其他方法进行干预治疗都成效甚微，并且常常需要影响细胞正常代谢。因此我们设计一种处理规范，利用A型肉毒毒素激活自噬而抑制凋亡，减轻缺血再灌注损伤，但不影响细胞正常代谢，从而提高真皮微血管内皮细胞的存活率。
技术实现思路
本专利技术人长期研究真皮微血管内皮细胞再灌注损伤的机制，发现缺血再灌注损伤会通过多种途径导致细胞凋亡，本专利技术通过多次细胞实验证实，A型肉毒素通过激活自噬而抑制真皮微血管内皮细胞的凋亡，减轻微血管内皮细胞的缺血再灌注损伤，本专利技术人采用图1的技术路线图实施实验。本专利技术所采用的技术方案分为三个部分，第一个部分：提取真皮微血管内皮细胞。取手术过程中多余的皮肤组织，皮瓣大小约1.5-2.0cm2。放入60mm的培养皿中，加入磷酸缓冲液冲洗多余的血液3次，每次5分钟。修剪皮瓣下的肌肉和多余的筋膜，最后修成0.5cm×0.5cm×0.1cm的组织条。将清洗和修剪的皮瓣组织置35mm皿中，加入2mg/mL中性蛋白酶(DispaseII)3mL，37℃孵箱消化90分钟。用整形镊小心分离真皮层和表皮层，将消化好的真皮置于另一个35mm小皿中，用磷酸盐缓冲液冲洗3遍。在小皿中加入浓度为1.25mg/mL胶原酶I1mL，37℃，40分钟孵育，再加入2mL的胎牛血清终止反应。用整形镊挤压皮瓣，然后小心将消化好的皮瓣组织以及消化液于40μm的滤器中过滤，将滤器置于50mL离心管上，并用适量的磷酸缓冲液冲洗滤器。将含有滤液的50mL的离心管置于离心机上，1000转/分钟，5分钟。去除上清液体，用1mL内皮细胞培养基(ECM)重悬。接种于预先包被明胶的60mm培养皿中。于37℃，5％CO2的培养箱中孵育。将孵育后的细胞在7-10天，消化接种于15cm培养皿中。3天后，再次消化，离心重悬至60μL，加入20μL的可结晶片段受体阻断剂(FcRBlockingReagent)，涡旋震荡，然后加入20μL的分化群31磁珠(CD31MicroBeads)，轻弹10次。于4℃孵育15分钟；加入1mL培养基，重悬，离心1000转/分，3分钟。弃上清，加入ECM培养基重悬到1mL。将重悬的细胞每次500μL通过放置于磁力架上的磁珠分选柱(MS柱)。然后用1mL培养基冲洗，人真皮微血管内皮细胞被标记，并且吸附在MS柱上，加入2mL培养基，将MS柱从磁力架上移下，用推动柱用力将MS柱中的培养液挤入15mL的离心管中，1000转/分钟，4分钟。将得到的细胞重悬接种于60mm皿中。培养8天后利用培养的细胞进行再一次磁珠分选，显微镜下观察内皮细胞形态。4天后，用同样的方法进行第三次磁珠分选，以获取独立的真皮微血管内皮细胞，提取的细胞生长情况如图二。上述的处理规划的第二个部分：应用A型肉毒毒素对实验组进行预处理。将已获的真皮微血管细胞进行传代培养，并随即分为八组备用，将所有细胞的培养基换为不含血清的ECM。取出呈粉末状的A型肉毒毒素，使用前将粉末状的A型肉毒毒素溶解于生理盐水中，再加入适量的ECM，配置成含有A型肉毒毒素10U/mL的ECM，放置于4℃储存，并在溶解后4小时内使用。取出其余的培养皿，分别用移液枪加入适量已经配好的含有A型肉毒毒素的ECM，摇匀，使得培养皿中原有的ECM和含有A型肉毒毒素的ECM混合均匀，各组培养皿中最终A型肉毒毒素的浓度分别为0.1U/mL、0.2U/mL、0.4U/mL、0.8U/mL、1.6U/mL、3.2U/mL，然后继续培养12小时。上述的处理规划的第三个部分：进行低氧/复氧，模拟缺血再灌注损伤过程。将八组细胞均置于低氧舱内，通入低氧气体(90％N2，5％CO2，5％O2)。第一组细胞低氧8小时后不做任何处理；后面第二组到第八组均将细胞置于低氧舱内8小时，然后置于普通培养箱内复氧24小时。为了验证处理规范的效果，可以对处理规范的结果的多个方面进行检验。验证过程中可以进行第九组实验，即在第八组的基础上可在加入A型肉毒毒素前加入25μM/mL自噬抑制剂二磷酸氯喹盐(CQ)，证明其作用原理。检验项目一：流式细胞术检测细胞凋亡率：用膜联蛋白-异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)凋亡检测试剂盒I进行检测。根据制造商的方案，收集细胞并重悬为1×106个细胞/mL的结合缓冲液中。然后，将100μL溶液(1x105细胞)转移到5mL培养管中，并添加5μL的AnnexinV-FITC和5μL碘化丙啶(PI)。混合物在室温下于黑暗中孵育15分钟。在通过流式细胞仪进行分析之前，将300μL结合缓冲液添加到每根试管中，然后即可进行分析。流式细胞仪实验采用以下对照组：未染色细胞、AnnexinV-FITC染色细胞和PI染色细胞。结果如图三。检验项目二：Western检测。IP细胞裂解液提取蛋白，用Bardford法测定蛋白浓度，取80μg蛋白，用15％的分离胶和10％的浓缩胶进行SDS一PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳。电泳电压80V跑胶，待样品跑至分离胶部分后改电压为120V电泳完毕后，剥离胶并剪切下来，电转90分钟将蛋白转移到PVDF膜上。脱脂奶粉中室温封闭1小时，LC3一抗1∶1000稀释，Beclin-1一抗1∶2000稀释，GAPDH一抗1∶2000稀释，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次5分钟。HRP标记的鼠源二抗1∶3000孵育3小时，TBST清洗3次，每次5分钟。用ECL显色，IPP6软件对图像进行灰度分析，结果如图四。检验项目三：免疫荧光染色。首先用PBS洗涤细胞，然后在室温下用4％中性缓冲甲醛固定15分钟，PBS清洗3次，每次5分钟。用0.1％TritonX-100破膜处理15分钟，然后在室温下与含有5％胎牛血清的PBS中孵育30分钟。用LC3一抗以1∶100的比例稀释后放置于含有3％胎牛血清的PBS中，4℃下于湿盒内过夜。用PBS洗涤细胞后，加入1∶200稀释的FITC偶联的山羊抗兔抗体，在黑暗中持续1小时。最后用DAPI复染细胞核。在荧光显微镜下观察载玻片并拍摄图像，结果如图五。为了减轻在体外培养细胞实验中的缺血再灌注损伤，本专利技术人采用A型肉毒毒素处理真皮微血管内皮细胞以减轻在培养过程中出现的缺血再灌注损伤，为其提供一种处理规范，提高细胞对缺氧的耐受能力，以便更好的进行细胞实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用A型肉毒毒素进行缺血再灌注损伤治疗实验领域的处理规范，其特征是：利用手术中多余的皮肤组织获取独立的微血管内皮细胞，之后进行分组，对实验组加入梯度浓度的A型肉毒毒素，然后再分别进行一定的缺氧处理和复氧处理，证实A型肉毒毒素可以改善缺血再灌注损伤，并可验证其原理。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用A型肉毒毒素进行缺血再灌注损伤治疗实验领域的处理规范，其特征是：利用手术中多余的皮肤组织获取独立的微血管内皮细胞，之后进行分组，对实验组加入梯度浓度的A型肉毒毒素，然后再分别进行一定的缺氧处理和复氧处理，证实A型肉毒毒素可以改善缺血再灌注损伤，并可验证其原理。


2.根据权利要求1所述的A型肉毒毒素治疗真皮微血管内皮细胞再灌注损伤处理规范，其特征是：在进行低氧/复氧前把其培养基换为不含血清的内皮细胞培养基(ECM)。


3.据权利要求1所述的A型肉毒毒素治疗真皮微血管内皮细胞再灌注损伤处理规范，其特征是：使用梯度浓度的A型肉毒毒素对其进行处理，其浓度分别为0.1U/mL、0.2U/mL、0.4U/mL、0.8U/mL、1.6U/mL、3.2U/...

【专利技术属性】
技术研发人员：林煌，史艳宇，李文志，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京安贞医院，
类型：发明
国别省市：北京;11