一种创建高棕榈酸和多叶片转基因植株的方法及应用技术

本发明专利技术涉及应用脂酰‑酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因创建高棕榈酸和多叶片转基因植株的方法及应用，包括：(1)花生脂酰‑酰基载体蛋白硫酯酶基因的克隆：利用Trizol进行花生种子RNA的提取，以RNA逆转录的cDNA为模板进行AhFATB2基因的扩增；(2)AhFATB2基因的植物过表达载体pBI‑AhFATB2的构建：用克隆得到的AhFATB2基因片段替换质粒pBI121上的GUS基因片段；(3)pBI‑AhFATB2在拟南芥中的遗传转化，获得转基因阳性植株。本发明专利技术以野生型植物为转基因受体，通过过表达AhFATB2基因，人工创建转基因植物。该方法可以提高植物种子中棕榈酸含量及其叶片生物量，具有一定开发价值。

【技术实现步骤摘要】
一种创建高棕榈酸和多叶片转基因植株的方法及应用
本专利技术涉及一种应用脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因创建高棕榈酸和多叶片转基因植株的方法及应用，属于植物基因工程

技术介绍
在脂肪酸合成过程中，脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶(Fat)通过催化硫酯键的水解决定了脂肪酸链长度。根据序列和底物的特异性Fat分为两类，分别是FatA和FatB，这两类Fat构成了TE14硫酯活性酶基因家族。FatA在不饱和长链脂酰-酰基载体蛋白合成中发挥特异性的作用，尤其在油酰辅酶A(oleoyl-ACP)的合成过程，而在饱和脂酰-酰基载体蛋白合成过程中活性较低。FatB主要以8-18碳链为底物生成的饱和脂酰-酰基载体蛋白。FatBs又可以分为FatB1和FatB2两个亚类，FatB1存在于所有植物中，主要以长链饱和酰基-ACP为底物，尤其是16:0-ACP；FatB2仅存在于积累8-14碳链脂肪酸的植物中，主要以短链及中链饱和脂肪酸为底物。Fat底物特异性对脂肪酸组分调控至关重要，因此Fat编码基因决定了脂肪组分。目前已经克隆了多种植物中以8-18碳链为底物的Fat基因，并且很多长链特异性的FatB通过转基因验证了功能。过表达GarmFatA1、MlFatB和AtFATA2导致硬脂酸(18:0)含量增加，过表达AtFatB1、BnFatB(2)，烟草中过表达CpFatB2a使得叶片中的十四烷酸含量(14:0)增加了46％，而过表达ClFatB1和GmFATA1同时增加了棕榈酸(16:0)和硬脂酸(18:0)的含量。JtFatB1、AtFatB主要增加了棕榈酸(16:0)的含量。油菜中过表达UcFatB1导致月桂酸(12:0)含量从忽略不计增加到接近60％，烟草中过表达CpFatB2a使得叶片中的十四烷酸含量(14:0)增加了46％，而过表达ClFatB1和GmFATA1同时增加了棕榈酸(16:0)和硬脂酸(18:0)的含量。棕榈酸(Palmiticacid)，是一种饱和高级脂肪酸，以甘油酯的形式普遍存在于动植物油脂中，主要来自于棕榈油和棕榈仁油。棕榈酸不含C＝C双键，属于饱和脂肪酸非必需脂肪酸，且与儿童生长发育和成长健康有关，更有降血脂、防治冠心病等治疗作用，且与智力发育、记忆等生理功能有一定关系。棕榈酸的酯化反应可以产生生物柴油，证明可作为生物柴油的原料油，棕榈酸酯是一种典型的脂肪酸酯，可用作增塑剂、表面活性剂、精细化工产品等的原料或中间体，广泛用于农业、食品、医药和精细化工产品的制造。东南亚国家利用优越的气候条件大量种植棕榈酸来获得棕榈酸，用在生物柴油的原料。因此棕榈酸在食品加工和工业生产中具有广泛的应用价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种应用脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因创建高棕榈酸和多叶片转基因植株的方法及应用。本专利技术方法以野生型植物为转基因受体，通过基因工程的手段，应用脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶(AhFATB2)基因，通过过表达AhFATB2基因，人工创建转基因植物。该转基因植物可以提高植物种子中棕榈酸含量及其叶片生物量，具有一定的开发价值。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因，所述AhFATB2基因的序列如SEQIDNO.3所示。一种应用脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因创建转基因植株的方法，以野生型植物为转基因受体，通过基因工程手段，应用脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因，通过过表达AhFATB2基因，人工创建转基因植物；所述AhFATB2基因的序列如SEQIDNO.3所示。所述的创建转基因植株的方法，包括以下步骤：(1)花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因的克隆；(2)AhFATB2基因的植物过表达载体pBI-AhFATB2的构建；(3)pBI-AhFATB2在拟南芥中的遗传转化和阳性苗筛选，获得转基因植株。所述AhFATB2基因的克隆方法为：利用Trizol进行花生种子RNA的提取，以RNA逆转录的cDNA为模板进行AhFATB2基因的扩增，引物为AhFATB2S和AhFATB2A；AhFATB2S:5′-CGCGGATCCATGGTTGCTACTGCTGCTACG-3′；AhFATB2A:5′-GACGAGCTCTCAGTTTTCTGCTGGAAAAACC-3′。所述AhFATB2基因扩增的反应体系为25μL内含：1×PCRbuffer，MgCI1.5mmol/L，dNTP0.2mmol/L，引物浓度均为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板100ng；PCR程序为：94℃，5min；94℃，45s，57℃，45s，72℃，2min，33个循环；72℃，10min。所述过表达载体pBI-AhFATB2的构建方法为：用步骤(1)克隆得到的AhFATB2基因片段替换质粒pBI121上的GUS基因片段。所述过表达载体pBI-AhFATB2构建的具体方法为：用BamHI和SacI双酶切克隆载体pBI121的GUS片段，同时用BamHI和SacI酶切步骤(1)克隆得到的AhFATB2基因片段；将AhFATB2基因片段的酶切产物和克隆载体pBI121上切下的片段混合，用DNA凝胶回收试剂盒回收，混合后加入T4DNA连接酶5单位，10×反应缓冲液，用无菌水补充体积至20μL，16℃连接过夜，转化后，即得重组质粒pBI-AhFATB2。所述步骤(3)的具体方法为：制备含有重组质粒pBI-AhFATB2的根癌农杆菌GV3101菌液，转化植株，筛选得到重组质粒pBI-AhFATB2成功转入植株的转基因阳性苗，将阳性苗自交3代以上，获得纯合植株HF-AhFATB2。所述阳性苗的筛选方法为：当叶片长到3-4叶期时，取绿苗叶片进行PCR阳性检测，引物为：AhFATB2S:5′-CGCGGATCCATGGTTGCTACTGCTGCTACG-3′；AhFATB2A:5′-GACGAGCTCTCAGTTTTCTGCTGGAAAAACC-3′；PCR反应体系为：基因组DNA模板1μL、10×Taq酶反应缓冲液2uL、25mMMgCL21.2uL、2mMdNTP1.5uL、10uM引物各0.2uL、0.3单位Taq酶，加无菌水至20μL；反应程序为：94℃变性5min；94℃，45s；55℃，45s；72℃，2min；32循环，72℃延伸5min。所述的脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因在提高油料作物种子棕榈酸含量和提高植物叶片生物量中的应用。本专利技术有益效果：本专利技术提供成功克隆了脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因，通过应用证明该基因可以应用于该转基因植物，可提高植物种子中棕榈酸含量及其叶片生物量，具有一定开发价值。本专利技术以野生型植物为转基因受体，通过过表达AhFATB2基因，人工创建了转基因植物。其中通过转基因技术过表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因，其特征在于，所述AhFATB2基因的序列如SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因，其特征在于，所述AhFATB2基因的序列如SEQIDNO.3所示。


2.一种应用脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因创建转基因植株的方法，其特征在于，以野生型植物为转基因受体，通过基因工程手段，应用脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因，通过过表达AhFATB2基因，人工创建转基因植物；所述AhFATB2基因的序列如SEQIDNO.3所示。


3.根据权利要求2所述的创建转基因植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因的克隆；
(2)AhFATB2基因的植物过表达载体pBI-AhFATB2的构建；
(3)pBI-AhFATB2在拟南芥中的遗传转化和阳性苗筛选，获得转基因植株。


4.如权利要求3所述的创建转基因植株的方法，其特征在于，所述AhFATB2基因的克隆方法为：利用Trizol进行花生种子RNA的提取，以RNA逆转录的cDNA为模板进行AhFATB2基因的扩增，引物为AhFATB2S和AhFATB2A；
AhFATB2S:5′-CGCGGATCCATGGTTGCTACTGCTGCTACG-3′；
AhFATB2A:5′-GACGAGCTCTCAGTTTTCTGCTGGAAAAACC-3′。


5.如权利要求4所述的创建转基因植株的方法，其特征在于，所述AhFATB2基因扩增的反应体系为25μL内含：1×PCRbuffer，MgCI1.5mmol/L，dNTP0.2mmol/L，引物浓度均为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板100ng；
PCR程序为：94℃，5min；94℃，45s，57℃，45s，72℃，2min，33个循环；72℃，10min。


6.如权利要求3所述的创建转基因植株的方法，其特征在于，所述过表达载体pBI-AhFATB2的构建方法为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张新友，石磊，苗利娟，黄冰艳，代小冬，张忠信，徐静，齐飞艳，孙子淇，秦利，董文召，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：河南;41