一种嵌合型植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用制造技术

本分案申请公开了一种十字花科嵌合型植物腈水解酶突变体，属于生物工程技术领域。本发明专利技术将高山南芥腈水解酶氨基酸序列的225‑285位肽段嵌入到缺失对应肽段的芜菁腈水解酶中，获得芜菁/高山南芥腈水解酶嵌合体BaNIT，进而对嵌合体BaNIT的编码基因进行定点饱和突变，使得嵌合体BaNIT的第279位的Q突变为E，获得嵌合型植物腈水解酶突变体BaNIT‑Q279E。本发明专利技术提供的植物腈水解酶突变体的催化活力提高1.41倍，重组蛋白的可溶性提高，对映体选择率E值保持在400以上，在高效催化外消旋异丁基丁二腈合成(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸中具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合型植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用本申请为申请号201810765047.5、申请日2018年7月12日、专利技术名称“一种植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用”的分案申请。
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种十字花科植物腈水解酶突变体、编码基因，及其在水解外消旋异丁基丁二腈制备普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。
技术介绍
腈类化合物是有机合成的重要中间体，可以合成酰胺、羧酸、氧肟酸等附加值更高、应用范围更广的化学品，广泛应用于化工、农药和医药等工业领域。但腈的化学水解往往需要强酸(或强碱)、高温、高压等反应条件，环境污染严重。腈水解酶生物催化具有高度的化学、区域及立体选择性，且反应条件温和、环境污染小，符合绿色可持续发展的要求，在有机化工领域具有广阔的应用前景。目前腈水解酶已成功应用于烟酸、(R)-扁桃酸和1,5-二甲基-2-哌啶酮等精细和医药化学品的工业化生产。随着现代分子生物学技术的发展以及工业生产环境对生物催化剂的需求，蛋白质分子改造已成为当前酶工程研究的热点。分子改造技术在腈水解酶催化活力、底物特异性、热稳定性和立体选择性等应用属性的改造中发挥了重要作用。Schreiner等对Alcaligenesfaecalis腈水解酶进行分子改造，获得了一株可以高效催化(R)-2-氯-扁桃腈水解合成(R)-2-氯-扁桃酸的突变体(EnzymeMicrob.Tech.,2010,47,140-146)。DeSantis等利用DNA改组技术改造腈水解酶，分别获得能够催化3-羟基戊二腈合成S-型和R-型产物的腈水解酶突变体，ee值大于95％，产率达到98％(J.Am.Chem.Soc.,2003,125,11476-11477)。外源基因在大肠杆菌表达的一个挑战是目的蛋白常形成无活性的包涵体，严重影响酶的催化性能。分子改造技术可通过替换某个或某几个氨基酸，减少包涵体的形成，提高蛋白的可溶性表达。Xie等人通过对LovD氨基酸序列半胱氨酸残基的替换，成功构建催化活力和蛋白可溶性表达均提高50％的双突变体C40A/C60N(Biotechnol.Bioeng.,2009,102,20-28)。普瑞巴林(Pregabalin，简称PGB)，化学名为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的3位异丁基取代物(Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,3500-3504)，是治疗脊髓损伤、焦虑以及癫痫等疾病的主要药物。腈水解酶区域、立体选择性水解外消旋异丁基丁二腈(IBSN)合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸((S)-CMHA)路线具有原料廉价、工艺简单、原子经济性高等显著优势。但目前已报道的腈水解酶催化活力及立体选择性低，不能满足工业化生产需求。因此，开发能够高效拆分IBSN的新型、高效腈水解酶具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可溶性和催化活性均提高的十字花科植物腈水解酶突变体，满足工业化生产的要求。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术将高山南芥腈水解酶(AaNIT)氨基酸序列的225-285位肽段嵌入到缺失对应肽段的芜菁腈水解酶(BrNIT)中，获得芜菁/高山南芥腈水解酶嵌合体(BaNIT)，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进而对嵌合体BaNIT的编码基因进行定点饱和突变，使得嵌合体BaNIT的第279位的Q突变为E，获得嵌合型植物腈水解酶突变体BaNIT-Q279E。BaNIT-Q279E(第279位的Q突变为E)氨基酸序列如SEQIDNO.8所示研究表明，相较于野生型腈水解酶，嵌合体(BaNIT)对底物外消旋IBSN的催化活性、立体选择性显著提升。上述的植物腈水解酶突变体的可溶性、催化活力比嵌合体(BaNIT)又有进一步的提升。对所述植物腈水解酶突变体的其他氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本专利技术的范围内。本专利技术还提供了编码所述植物腈水解酶突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。本专利技术还提供了包含所述编码基因的重组载体。作为优选，原始载体为pET28b。本专利技术还提供了包含所述重组载体的重组基因工程菌。所述重组载体转化宿主细胞获得重组基因工程菌，所述宿主细胞可以为本领域的各种常规宿主细胞，作为优选，宿主细胞为大肠杆菌E.coliBL21。本专利技术还提供了一种构建所述的植物腈水解酶突变体的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：(1)针对芜菁腈水解酶基因序列，设计PCR引物，以高山南芥cDNA为模板，利用所述PCR引物扩增获得含有高山南芥腈水解酶核苷酸序列675-855位的DNA片段Ⅰ；(2)以携带有芜菁腈水解酶基因的重组质粒为模板，利用反向PCR扩增获得芜菁腈水解酶核苷酸序列678-858位缺失的BrNIT质粒片段；(3)将DNA片段Ⅰ和BrNIT质粒片段重组，再将重组产物转化至宿主菌，筛选获得重组后的亲本腈水解酶表达菌株，其中亲本腈水解酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(4)设计定点突变引物，以步骤(3)获得的携带有亲本腈水解酶基因的重组质粒为模板，进行重叠延伸PCR，获得亲本腈水解酶中第279位的Q突变为E的单位点突变产物；(5)将所述单位点突变产物转化至宿主菌，筛选获得腈水解酶突变体表达菌株，诱导表达，获得所述的植物腈水解酶突变体。步骤(1)-(3)中，采用一步克隆的方法将高山南芥腈水解酶(AaNIT)225-285位肽段对应的核苷酸序列嵌入到缺失对应肽段的芜菁腈水解酶(BrNIT)质粒片段中，获得亲本腈水解酶(BaNIT)工程菌。其中扩增DNA片段Ⅰ所需的引物：上游引物：5’-GAATGGCAGTCTTCTATGATGCACATCGC-3’(SEQIDNO.17)；下游引物：5’-GAAGTTCGGACCAGCCAGAACCTGACCC-3’(SEQIDNO.18)。扩增BrNIT质粒片段所需引物：上游引物：5’-GCGATGTGCATCATAGAAGACTGCCATTC-3’(SEQIDNO.19)；下游引物：5’-GGGTCAGGTTCTGGCTGGTCCGAACTTC-3’(SEQIDNO.20)。步骤(4)中，对亲本腈水解酶基因进行饱和定点突变。其中279位的Gln突变为Glu所需的引物：上游引物：5’-CATCTCTCCGCTGGGTCAGGTTCTGGCTGG-3’(SEQIDNO.25)；下游引物：5’-CCAGCCAGAACCTGACCCAGCGGAGAGATG-3’(SEQIDNO.26)。进一步地，所述制备方法还包括：步骤(5)中，以所述单位点突变产物为模板，利用定点突变引物进行重叠延伸PCR获得第263位的H突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物腈水解酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种植物腈水解酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。


2.一种编码如权利要求1所述的植物腈水解酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。


3.一种包含如权利要求2所述的编码基因的重组载体。


4.一种包含如权利要求3所述的重组载体的重组基因工程菌。


5.一种植物腈水解酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对芜菁腈水解酶基因序列，设计PCR引物，以高山南芥cDNA为模板，利用所述PCR引物扩增获得含有高山南芥腈水解酶核苷酸序列675-855位的DNA片段Ⅰ；
(2)以携带有芜菁腈水解酶基因的重组质粒为模板，利用反向PCR扩增获得芜菁腈水解酶核苷酸序列678-858位缺失的BrNIT质粒片段；
(3)将DNA片段Ⅰ和BrNIT质粒片段重组，再将重组产物转化至宿主菌，筛选获得重组后的亲本腈水解酶表达菌株，其中亲本腈水解酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
(4)设计定点突变引物，以步骤(3)获得的携带有亲本腈水解酶基因的重组质粒为模板，进行重叠延伸PCR，获得亲本腈水解酶中第279位的Q突变为E的单位点突变产物；
(5)将所述单位点突变产物转化至宿主菌，筛选获得腈水解酶突变体表达菌株，诱导表...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑仁朝，郑裕国，张琴，汤晓玲，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33