本发明专利技术属于饲料生物技术领域，具体涉及一种多聚半乳糖醛酸酶突变体及其编码基因和应用。是以一种以来源于Talaromyces leycettanus JCM12802的多聚半乳糖醛酸酶作为母本，经点突变获得的突变体E247C/S276C。本发明专利技术的多聚半乳糖醛酸酶突变体与野生型多聚半乳糖醛酸酶相比，多聚半乳糖醛酸酶热稳定性增强，70℃处理30min仍保留21.78％左右的活性，而野生酶活性已经消失。此外，野生型比活为50483U/mg，突变体的比活为46270U/mg，可以应用于能源、食品和饲料领域中。
【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性提高的多聚半乳糖醛酸酶突变体及应用
：本专利技术属于饲料生物
，具体涉及一种多聚半乳糖醛酸酶突变体及其编码基因和应用。
技术介绍
：聚半乳糖醛酸酶(PGs)水解连接半乳糖醛酸残基的α-1,4-糖苷键，在果胶的降解中起到关键作用。其中真菌来源的PG具有很高的活性，通常在弱酸性pH值和30至50℃的最佳温度下具有最佳活性。但是由于其较低的热稳定性限制了其在食品以及饲料工业中的应用。那么开发一种新的耐高温的多聚半乳糖醛酸酶已迫在眉睫。目前，研究最广泛的是通过蛋白质工程对酶分子进行改造，以提高酶的热稳定性。通过合理设计改善蛋白质热稳定性的策略一般包括以下几方面：蛋白质表面电荷的优化，二硫键的引入，脯氨酸效应，蛋白质展开的自由能设计，温度因子(B因子)等策略。本专利技术主要是通过在多聚半乳糖醛酸酶的结构中引入二硫键来达到提高酶热稳定性的目的，通过计算机对酶蛋白的三维结构进行解析，在不同的位点加入二硫键，发现在关键位点引入二硫键后显著提高了酶的热稳定性。
技术实现思路
：本专利技术的一个目的是提供一种以来源于TalaromycesleycettanusJCM12802的多聚半乳糖醛酸酶作为母本，经点突变获得的突变体E247C/S276C。本专利技术的再一目的是提供编码上述突变体的基因，如SEQIDNO.3所示。本专利技术的再一目的是提供上述突变体的氨基酸序列，如SEQIDNO.2所示。本专利技术的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组菌株。根据本专利技术的具体实施方式，对氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的野生型多聚半乳糖醛酸酶进行定点突变。SEQIDNO.1MHTIQPLLTYGLAVGAVLSSAAPTAVEKRASCTFTDAASAMASKTACSTITLNNIAVPAGTTLDLTGLTSGTRVIFEGTTTFGYQEWSGPLVSISGTDITVQGASGSVLDGDGARWWDGQGSNGGKTKPKFFYAHSLDSSSITGITIKNSPVQVFSIQSNNLSLTDITVDDADGDTQGGHNTDAFDIGSSTYITITNANVHNQDDCIAVNSGENIIFTGGTCTGGHGLSIGSVGGRSDNTVKNVTIEHSTVTNSQNGVRIKTVYGATGSVSEVTYSNIQMSGITNYGIVIEQDYENGSPTGTPTNGVPITDLTLNTVTGSVSSGATEIYILCGSGSCSSWTWTGVSITGGSKSTKCENVPSGVSC本专利技术将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的野生型多聚半乳糖醛酸酶进行247和276位点的突变，分别将谷氨酸和丝氨酸突变为半胱氨酸，从而获得多聚半乳糖醛酸酶突变体E247C/S276C。根据本专利技术的具有高热稳定性的多聚半乳糖醛酸酶突变体具有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，由365个氨基酸组成。SEQIDNO.2：MHTIQPLLTYGLAVGAVLSSAAPTAVEKRASCTFTDAASAMASKTACSTITLNNIAVPAGTTLDLTGLTSGTRVIFEGTTTFGYQEWSGPLVSISGTDITVQGASGSVLDGDGARWWDGQGSNGGKTKPKFFYAHSLDSSSITGITIKNSPVQVFSIQSNNLSLTDITVDDADGDTQGGHNTDAFDIGSSTYITITNANVHNQDDCIAVNSGENIIFTGGTCTGGHGLSIGSVGGRSDNTVKNVTICHSTVTNSQNGVRIKTVYGATGSVSEVTYCNIQMSGITNYGIVIEQDYENGSPTGTPTNGVPITDLTLNTVTGSVSSGATEIYILCGSGSCSSWTWTGVSITGGSKSTKCENVPSGVSC本专利技术还提供编码上述具有高热稳定性的多聚半乳糖醛酸酶突变体的基因，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，共为1098bp(包含终止子)。SEQIDNO.3：ATGCATACGATCCAACCTCTTCTAACCTATGGGCTGGCCGTGGGAGCTGTCCTTTCCTCAGCGGCCCCAACTGCTGTCGAGAAGCGTGCCAGCTGCACCTTTACCGATGCTGCTTCTGCCATGGCAAGCAAGACAGCCTGCTCGACTATCACGCTGAACAACATTGCCGTTCCTGCTGGGACCACCTTGGACCTGACGGGCTTGACATCCGGCACCAGGGTCATCTTCGAAGGAACAACCACCTTTGGATACCAGGAATGGAGCGGTCCCCTGGTTTCTATCTCCGGCACCGATATTACCGTTCAGGGTGCTTCGGGCTCCGTGCTTGACGGTGACGGTGCCCGCTGGTGGGATGGACAGGGCAGCAATGGCGGCAAGACCAAGCCCAAGTTCTTCTACGCCCATAGCTTGGACTCTTCGTCCATCACTGGCATTACTATCAAGAACTCCCCTGTTCAAGTCTTCAGCATCCAGTCCAACAATTTGAGCCTGACGGATATCACCGTCGATGACGCCGATGGCGACACCCAAGGCGGCCACAATACCGACGCCTTTGATATCGGTAGCTCCACTTATATCACGATCACGAACGCTAATGTTCACAATCAGGATGACTGCATTGCAGTCAACTCAGGGGAGAACATCATCTTCACTGGCGGCACCTGCACCGGCGGCCACGGTCTCTCCATCGGCTCTGTCGGCGGCCGCTCAGACAACACCGTCAAGAACGTCACCATCTGTCACTCCACCGTGACCAACTCCCAGAATGGCGTGCGTATCAAGACCGTGTACGGCGCGACCGGCTCCGTCTCCGAAGTCACTTACTGTAACATCCAAATGTCTGGAATCACGAACTATGGCATCGTGATCGAGCAGGACTACGAGAACGGCAGCCCAACTGGTACCCCGACAAACGGTGTCCCTATTACAGATCTCACTCTCAATACTGTGACTGGTAGCGTTTCGAGTGGTGCTACGGAGATTTACATTCTCTGCGGATCTGGAAGCTGCTCTAGTTGGACTTGGACGGGTGTTTCAATTACTGGTGGCTCGAAGAGCACTAAATGTGAGAATGTGCCTTCTGGAGTTTCTTGCTAG本专利技术还提供包含上述多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组载体；优选地，所述重组载体的表达载体具体为pPIC9质粒。本专利技术还提供包含上述多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组菌株；优选地，所述重组菌株采用的宿主为GS115。本专利技术还提供制备具有高比活本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多聚半乳糖醛酸酶突变体，其特征在于，所述突变体具体为E247C/S276C，氨基酸序列如序列表如SEQ ID NO.2所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种多聚半乳糖醛酸酶突变体，其特征在于，所述突变体具体为E247C/S276C，氨基酸序列如序列表如SEQIDNO.2所示。
2.权利要求1所述多聚半乳糖醛酸酶突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，如序列表SEQIDNO.3所示。
4.含有权利要求1所述多聚半乳糖醛酸酶突变体编码基因的重组载体或重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，采用的表达载体为pPIC9质粒。
6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，采用的宿主为毕赤酵母GS115。
【专利技术属性】
技术研发人员：刘文龙，涂涛，佟新伟，王兴吉，王克芬，张杰，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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