一种能抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶GANTB及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶GANTB及其应用。抗单端孢霉烯族毒素新型酰基转移酶GANTB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。因此本发明专利技术从深海真菌FS140的cDNA文库中获得了抗单端孢霉烯族毒素新型酰基转移酶GANTB序列，并成功导入到酿酒酵母S.cerevisiae BJ5464中进行了抗毒功能验证，从而为后期提高酿酒酵母抗单端孢霉烯族毒素的能力，提升单端孢霉烯族毒素的异源表达水平并获得新型单端孢霉烯族毒素奠定分子生物学基础。

【技术实现步骤摘要】
一种能抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶GANTB及其应用
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种能抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶GANTB及其应用。
技术介绍
真菌毒素是产毒真菌在生长过程中产生的一类次生代谢物质，危害比较大的主要包括单端孢霉烯族毒素、黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮等。特别是单端孢霉烯族毒素，被认为是最危险的自然发生粮食污染物，已成为国际研究热点。单端孢霉烯族毒素是一大类由镰刀菌产生的化学结构相似的毒性物质的统称，其基本结构为四环的倍半萜，根据取代基的不同，可以分为A、B、C、D四种类型。是一类全球性的谷物污染物，在多种谷物小麦、玉米、燕麦、大麦、黑麦、谷物制品面包、啤酒、谷物类早餐和词料中均有检出。迄今为止已经发现了大概170种单端孢霉稀族毒素，而A型和B型单端孢霉稀族毒素污染率最高，包括DON、3-ADON、15-ADON、NIV、T-2和DAS毒素等，其中污染率和含量最高的是DON,因此,阻止和减少DON毒素进入人和动物的食物链以防止其危害为主要研究内容。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),属B族单端孢霉烯族毒素，是世界上分布最广泛的真菌毒素之一,DON毒素可以通过污染小麦,大麦,玉米等原料进入食品和饲料,家畜和家禽食用污染的饲料还会使不毒素进入牛奶,肉和禽蛋中从而间接影响人类健康,因此,阻止和减少不毒素进入人和动物的食物链以防止其危害为主要研究内容。目前DON毒素的防控技术主要包括田间污染控制,食品和饲料的脱毒及抑制毒素在胃肠道的吸收。MR4，是本课题组从广藿香植物中分离的露湿漆斑菌MyrotheciumroridumA553(GenBank:KJ813720)中分离得到的杆孢菌素E异构体，属D型单端孢霉烯族毒素,具有强抗肿瘤活性，但对于人体和农产品的危害未知，有待于进一步研究。由于传统的物理和化学消除方法存在效果不稳定、营养成分损失大、影响饲料适口性，且难以规模化生产等缺点而不能广泛应用到实际生产中。微生物及生物酶降解具有解毒效率高、特异性强、对饲料和环境没有污染等特点和优势，从而备受研究者的关注。近年来已有报道降解玉米赤霉烯酮的微生物菌株，也有一些降解呕吐毒素的降解酶的研究报道，这些报道大多数是单一或混合菌株降解一种毒素，目前还没有关于单一的酶同时抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的研究报道。本专利技术公开了一种能同时抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON和杆孢菌素E两种单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶GANTB，为有效控制和消除脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON和杆孢菌素E对粮食和饲料的污染和帮助宿主抵抗毒素危害，改善动物生产性能和保障人类食品安全有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种能抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶GANTB，所述的酰基转移酶GANTB，其由核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的序列编码而成。本专利技术能抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶GANTB通过以下方法获得的：通过转录组测序结果预测编码酰基转移酶基因GANTB的序列，在其上下游设计特异性引物，其引物序列为GANTB-F:5'-ATGTCCTACCAGTCTACAATCTACACCT-3'；GANTB-R:5'-CTACACTATATCCTTATCGCAACCCACC-3'，以由深海真菌FS140转录组反转录而得的cDNA文库为模板，通过PCR扩增获得产物并纯化回收片段，获得酰基转移酶基因GANTB，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术利用同源重组法将GANTB基因插入到酵母载体YEp352-TEF1-CYC1的表达盒内部。首先设计含有同源臂的GANTB基因的上下游引物，其引物序列为YEp352-GANTB-F:5'-TAGCAATCTAATCTAAGTCTAGAATGTCCTACCAGTCTACAATCTA-3'；YEp352-GANTB-R:5'-TACATGATGCGGCCCGTCGACCTACACTATATCCTTATCGCAACCCA-3(下划线序列为同源臂片段)，通过PCR扩增获得产物并纯化回收片段。对已构建的YEp352-TEF1-CYC1载体采用内切酶SalI和XbaI双酶切，然后使用ClonExpressIIOneStepCloningKitC112(Vazyme)将片段和酶切载体重组连接并转化至大肠杆菌感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板筛选出阳性克隆。经过此轮分子克隆，目的基因GANTB(其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)插入到启动子TEF1和终止子CYC1之间，构建得到YEp352-TEF1-GANTB载体，将其电转入酿酒酵母BJ5464-D细胞中，利用尿嘧啶缺陷型的SD培养基平板进行筛选和验证。与转入YEp352-TEF1-CYC1质粒(阴性对照)的酿酒酵母BJ5464-D相比，含有重组载体YEp352-TEF1-GANTB的酿酒酵母生长速度明显加快，相同培养时间内菌落密度更高，证明功能基因GANTB能有效协助酿酒酵母抵抗单端孢霉烯族毒素，为在酿酒酵母内重构单端孢霉烯族毒素生物合成通路奠定基础，利于下一步分离纯化酰基转移酶GANTB，明确其对真菌毒素降解效果，为开发成经济、可行的降毒试剂、防控真菌毒素添加剂等提供新思路。本专利技术的第二个目的是提供一种表达载体，含有上述的能抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶基因GANTB。本专利技术的第三个目的是提供一种宿主细胞，含有上述的表达载体。所述的宿主细胞优选为酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeBJ5464。本专利技术的第四个目的是提供上述的能抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶基因GANTB在协助宿主细胞抵抗单端孢霉烯族毒素(B型和/或D型单端孢霉烯族毒素)中的应用。所述的宿主细胞优选为深海真菌GeosmithiapallidaFS140或酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeBJ5464。本专利技术的第五个目的是提供一种表达盒，该表达盒含有上述的能抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶基因GANTB。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术所涉及的深海真菌GeosmithiapallidaFS140分离自南海沉积物，本课题组前期对该菌株进行了转录组测序并对基因进行了注释。鉴于目前尚未有关于深海真菌GeosmithiapallidaFS140抗单端孢霉烯族毒素研究。众多研究表明，能够转化降解单端孢霉烯族毒素的微生物广泛存在于自然界中，但目前得到实际应用的却不多，唯一商品化应用的是基于菌株BBSH797的饲料添加剂产品，在食品工业领域还没有得到这方面的应用。这主要的原因可能是还没有找到一种高效、安全的，可用于食品工业的脱毒微生物，以及对微生物脱毒作用的机理，特别是微生物产生的脱毒酶类还不是很了解，这些方面还需要深入的研究。此外，目前还没有关于单一的酶同时抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的研究报道。因此本专利技术从深海真菌FS140的cDNA文库中获得了抗单端孢霉烯族毒素酰基转移酶基因GANTB序列，并成功导入到酿酒酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶GANTB，其特征在于，其由如SEQID NO.1所示的核苷酸序列编码。/n

【技术特征摘要】
1.一种能抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶GANTB，其特征在于，其由如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码。


2.一种能抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶基因GANTB，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的抗能抗B型和D型单端孢霉烯族毒素的酰基转移酶基因GANTB。


4.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的表达载体。


5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为酿酒酵母Saccharomycescerev...

【专利技术属性】
技术研发人员：李赛妮，章卫民，刘洪新，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东;44