一种激活NK样细胞的工程化细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种激活NK样细胞的工程化细胞及其制备方法和应用，所述工程化细胞为表达膜蛋白MICA、IL‑21、CD64和CD86的哺乳动物细胞。本发明专利技术的工程化细胞表达活化NK样细胞的膜蛋白，提高了NK样细胞的扩增能力和肿瘤细胞毒性，提供了一种标准化体外扩增NK样细胞的策略。

【技术实现步骤摘要】
一种激活NK样细胞的工程化细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种激活NK样细胞的工程化细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
NK样细胞为利用CRISPR/Cas9技术对T细胞进行重编程而获得的细胞，NK样细胞具有T细胞和NK细胞的双重功能，不依赖于主要组织相容性复合体(MHC)，相较于T细胞或NK细胞具有显著提高的肿瘤杀伤功能，在癌症治疗中展现出了巨大的潜力。将NK样细胞应用于免疫治疗的一大障碍是难以生产大量功能完全的NK样细胞，同时缺少体外扩增NK样细胞的标准方法。目前常用的NK细胞的培养方法包括血液细胞分离法、细胞因子或化学药品刺激法和饲养细胞法，但是这些方法普遍存在着操作繁琐、成本高、周期长、数量无法满足需求的问题，且不十分适用于NK样细胞的培养。近年来，使用基因工程技术构建的人工抗原呈递细胞(滋养层细胞)越来越多地应用于NK细胞的体外扩增。但是NK样细胞不同于NK细胞，其具有T细胞和NK细胞双重功能，目前尚无有效的体外扩增和活化NK样细胞的方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种激活NK样细胞的工程化细胞及其制备方法和应用，所述工程化细胞表面表达有活化NK样细胞的膜蛋白，通过与NK样细胞受体结合，实现了激活NK样细胞的效果。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种激活NK样细胞的工程化细胞，所述工程化细胞为表达膜蛋白MICA、IL-21、CD64和CD86的哺乳动物细胞。<br>本专利技术中，将MICA、IL-12、CD64和CD86表达于哺乳动物细胞表面构建激活NK样细胞的工程化细胞，通过与NK样细胞表面的受体结合用于活化NK样细胞，显著提高了NK样细胞的扩增数量和肿瘤细胞毒性。优选地，所述MICA包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；SEQIDNO:1：MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQTFHVSAVAAAAIFVIIIFYVRCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTSDHRDATQLGFQPLMSDLGSTGSTEGA。优选地，所述IL-12通过与CD28跨膜区形成融合蛋白、表达在所述工程化细胞表面。优选地，所述IL-12包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；SEQIDNO:2：MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAGGGGSMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYY。优选地，所述CD28跨膜区包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；SEQIDNO:3：IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV。优选地，所述CD64包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；SEQIDNO:4：MWFLTTLLLWPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWVDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNTSVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHVLFYLAVG。优选地，所述CD86包括SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；SEQIDNO:5：MGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF。优选地，所述哺乳动物细胞包括K562细胞。第二方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体包括MICA编码基因、IL-12和CD28跨膜区融合蛋白编码基因、CD64编码基因和CD86编码基因。优选地，所述表达载体包括病毒载体。优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。第三方面，本专利技术提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用第二方面所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种激活NK样细胞的工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞为表达膜蛋白MICA、IL-21、CD64和CD86的哺乳动物细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种激活NK样细胞的工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞为表达膜蛋白MICA、IL-21、CD64和CD86的哺乳动物细胞。


2.根据权利要求1所述的工程化细胞，其特征在于，所述MICA包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述IL-12通过与CD28跨膜区形成融合蛋白、表达在所述工程化细胞表面；
优选地，所述IL-12包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；
优选地，所述CD28跨膜区包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；
优选地，所述CD64包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；
优选地，所述CD86包括SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的工程化细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞包括K562细胞。


4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括MICA编码基因、IL-12和CD28跨膜区融合蛋白编码基因、CD64编码基因和CD86编码基因。


5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括病毒载体；
优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。


6.一种重...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤朝阳，秦乐，吴迪，冯世忠，冯嘉昆，杨乐旋，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：广东昭泰体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44