一种青蒿内生菌的分离纯化方法及其应用技术

一种青蒿内生菌的分离纯化方法，包括以下步骤：1)采集青蒿的完整植株，清洗，分别取根、茎、叶；2)分别对根、茎、叶进行表面消毒处理；3)取叶，用无菌水进行研磨，静置，取上清液，取茎，切为小段，取根，切为小段，分别将上清液、茎段、根段的切面向下置于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上；4)将步骤3)得到的牛肉膏蛋白胨平板倒置于36±1℃环境下培养1～2d，得到的高氏一号平板、PDA平板倒置于28℃环境下培养7d；5)待各平板上菌落长出，判断菌落的种类，经多次分离、纯化，分别得到纯化的细菌典型菌落、放线菌典型菌落、真菌典型菌落。本发明专利技术分离过程简单、高效，可有效分离得到青蒿内生菌，且进行初步分类。

【技术实现步骤摘要】
一种青蒿内生菌的分离纯化方法及其应用
本专利技术涉及医药领域，特别涉及一种青蒿内生菌的分离纯化方法及其应用。
技术介绍
植物内生菌是一类重要的微生物资源，从20世纪90年代起逐渐成为微生物学家们关注的热点。近年来，越来越多的研究证明内生菌可产生与宿主植物相同或相似的次级代谢产物，因此从植物内生菌中获得各种新资源的可能性是十分巨大的。从药用植物中分离、筛选能够产生与宿主植物相同或相似生物活性物质的内生菌已成为筛选微生物药物的重要来源，特别是以抗菌、抗肿瘤等指标为主的药物开发，是植物内生微生物研究中最耀眼的亮点。青蒿是菊科植物黄花蒿的全草，具有抗疟、抗菌、抗肿瘤、抗寄生虫、免疫调节等作用。药用植物青蒿化学成分中的挥发油和青蒿素都具有抗菌作用。青蒿内生菌长期与青蒿共存，可能产生青蒿挥发油或青蒿素，从而使内生菌具有抑菌作用。国内外关于内生菌的研究报道很多，但关于青蒿内生菌抑菌作用的资料较少。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种青蒿内生菌的分离纯化方法，其分离过程简单、高效，可有效分离得到青蒿内生菌，且进行初步分类。本专利技术的技术方案是：一种青蒿内生菌的分离纯化方法，包括以下步骤：1)采集青蒿的完整植株，清洗，分别取下完整植株的根、茎、叶；2)分别对步骤1)得到的根、茎、叶进行表面消毒处理；3)取叶，用无菌水进行研磨，静置，取上清液，涂布在牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上，取茎，切为小段，切面向下置于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上；取根，切为小段，切面向下置于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上；4)将步骤3)得到的牛肉膏蛋白胨平板倒置于36±1℃环境下培养1-2d，得到的高氏一号平板、PDA平板倒置于28℃环境下培养7d；5)待各平板上菌落长出，判断菌落的种类，经多次分离、纯化，分别得到纯化的细菌典型菌落、放线菌典型菌落、真菌典型菌落。进一步的，步骤1)所述青蒿的完整植株，为9月份采集的健康、无病虫害的野生青蒿，所述清洗，为用流水冲洗。进一步的，步骤2)所述表面消毒的方法为，分别将根、茎、叶用流水冲洗5h，用滤纸将根、茎、叶表面的水分吸干，经紫外线照射20min后，用75％酒精浸泡2min，然后用无菌水冲洗三次，再用5.4％的NaClO溶液浸泡，其中，根和茎的浸泡时间为10min，叶的浸泡时间为5min，最后用无菌水漂洗三次。进一步的，步骤2)消毒处理后，采用漂洗液检查法和组织印迹检查法进行可靠性检验。进一步的，漂洗液检查法的步骤为：第三次漂洗后的无菌水分别吸取0.1mL涂布于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上，牛肉膏蛋白胨平板倒置于36±1℃环境下培养1-2d，高氏一号平板、PDA平板倒置于28℃环境下培养7d，无菌落长出证明消毒彻底；组织印迹检查法的步骤为：用无菌镊子夹住第三次漂洗完毕的茎和根，使其表面分别与牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板接触5min后取出，牛肉膏蛋白胨平板倒置于36±1℃环境下培养1-2d，高氏一号平板、PDA平板倒置于28℃环境下培养7d，无菌落长出证明消毒彻底。进一步的，步骤5)得到的细菌典型菌落、放线菌典型菌落、真菌典型菌落，分别转移至斜面上，待菌株生长旺盛时取出，置于4℃冰箱保藏备用。本专利技术还提供了一种内生菌发酵液的抑菌活性检测方法，包括以下步骤制备得到：1)取任一上述分离纯化方法得到的细菌典型菌落、放线菌典型菌落、真菌典型菌落，分别经活化，得到青蒿内生细菌、青蒿内生放线菌、青蒿内生真菌；2)青蒿内生细菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放入35℃摇床，培养24h，青蒿内生放线菌接入高氏一号液体培养基中，放入28℃摇床，培养5d，青蒿内生真菌接入PDA液体培养基中，放入28℃摇床，培养5d；3)培养得到的青蒿内生细菌悬液、青蒿内生放线菌悬液、青蒿内生真菌悬液分别移入离心管中，经离心，取上清液，得到内生菌的发酵液。进一步的，步骤3)所述离心，离心参数为12000r/min，离心时间为10min。本专利技术还请求保护上述内生菌的发酵液在用于抑菌中的应用。具体的，所述抑菌，是用于抑制革兰氏阴性大肠埃希菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌、革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、黑曲霉和酿酒酵母。采用上述技术方案具有以下有益效果：1、本专利技术取青蒿完整植株的根、茎、叶作为分离对象，便于比较青蒿各部位内生菌数量的多少和不同部位分离到的内生菌抑制细菌和抑制真菌的活性。2、本专利技术表面消毒方式采用先流水冲洗，再紫外线照射，然后75％酒精消毒，最后次氯酸钠消毒。几种消毒方式相结合，既可以保证消毒效果，同时选择的消毒剂均易清洗，对材料的残毒效应小，对内部的内生菌无抑制作用。通过漂洗液检查和组织印迹两种方法检查表面消毒效果，保证分离到的是内生菌，避免杂菌污染。本专利技术采用特定组合方式对采集的材料进行表面消毒灭菌，可以有效除掉和杀死材料表面的微生物，保证后续顺利分离到比较多的内生菌。若采用其他的消毒方法，会出现材料表面消毒不彻底，导致内生菌受杂菌污染，无法保证分离到的都是内生菌；或者出现消毒灭菌过量，灭活材料内部的内生菌，导致分离到的内生菌数量少，难以得到具有较好抑菌效果的发酵液。3、本专利技术将青蒿叶的上清液、青蒿茎段、青蒿根段分别接种在牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板，将青蒿植株内的内生菌分类培养得到对应的内生细菌、内生放线菌、内生真菌。经申请人试验验证，采用本专利技术分离方法得到的青蒿内生菌培养得到的发酵液，对革兰氏阴性大肠埃希菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉和酿酒酵母有显著的抑制作用。下面结合附图和具体实施方式作进一步的说明。附图说明图1为实施例二青蒿内生真菌的抑菌效果初筛图；图2为实施例三青蒿内生菌发酵液的抑菌效果图。具体实施方式本专利技术中，使用的牛肉膏蛋白胨培养基用于内生细菌的分离和培养、指示细菌的培养；高氏一号培养基用于内生放线菌的分离和培养；PDA培养基用于内生真菌的分离和培养、指示真菌的培养。实施例一青蒿内生菌的分离纯化(1)采样9月份从涪陵蒿枝坝采集健康、无病虫害野生青蒿的完整植株，取样后流水冲洗干净，分别取下其根、茎、叶。(2)表面消毒分别将青蒿的根、茎、叶流水冲洗5h后，用滤纸将各材料水分吸干后，分别称取根、茎、叶3g放入超净工作台中紫外灯照射20min后，用无菌镊子夹入无菌烧杯里，用75％酒精浸泡2min，无菌水冲洗3次，再用5.4％NaClO溶液浸泡一定时间，其中，根和茎的浸泡时间为10min，叶的浸泡时间为5min，最后用无菌水冲洗3次。(3)内生菌的分离将消过毒的青蒿的叶用无菌水进行研磨，静置5min，分别取上清液0.1mL，涂布在牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上。将消过毒的青蒿的根和茎用无菌解剖刀切成1cm左右的小段，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种青蒿内生菌的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)采集青蒿的完整植株，清洗，分别取下完整植株的根、茎、叶；/n2)分别对步骤1)得到的根、茎、叶进行表面消毒处理；/n3)取叶，用无菌水进行研磨，静置，取上清液，涂布在牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上，取茎，切为小段，切面向下置于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上，取根，切为小段，切面向下置于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上；/n4)将步骤3)得到的牛肉膏蛋白胨平板倒置于36±1℃环境下培养1～2d，得到的高氏一号平板、PDA平板倒置于28℃环境下培养7d；/n5)待各平板上菌落长出，判断菌落的种类，经多次分离、纯化，分别得到纯化的细菌典型菌落、放线菌典型菌落、真菌典型菌落。/n

【技术特征摘要】
1.一种青蒿内生菌的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采集青蒿的完整植株，清洗，分别取下完整植株的根、茎、叶；
2)分别对步骤1)得到的根、茎、叶进行表面消毒处理；
3)取叶，用无菌水进行研磨，静置，取上清液，涂布在牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上，取茎，切为小段，切面向下置于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上，取根，切为小段，切面向下置于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上；
4)将步骤3)得到的牛肉膏蛋白胨平板倒置于36±1℃环境下培养1～2d，得到的高氏一号平板、PDA平板倒置于28℃环境下培养7d；
5)待各平板上菌落长出，判断菌落的种类，经多次分离、纯化，分别得到纯化的细菌典型菌落、放线菌典型菌落、真菌典型菌落。


2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)所述青蒿的完整植株，为9月份采集的健康、无病虫害的野生青蒿，所述清洗，为用流水冲洗。


3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)所述表面消毒的方法为，分别将根、茎、叶用流水冲洗5h，用滤纸将根、茎、叶表面的水分吸干，经紫外线照射20min后，用75％酒精浸泡2min，然后用无菌水冲洗三次，再用5.4％的NaClO溶液浸泡，其中，根和茎的浸泡时间为10min，叶的浸泡时间为5min，最后用无菌水漂洗三次。


4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)消毒处理后，采用漂洗液检查法和组织印迹检查法进行可靠性检验。


5.根据权利要求4所述的分离纯化方法，其特征在于，所述漂洗液检查法的步骤为：第三次漂洗后的无菌水分别吸取0.1mL涂布于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上，牛肉膏蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玲玲，
申请(专利权)人：重庆工贸职业技术学院，
类型：发明
国别省市：重庆;50