一种贻贝黏蛋白的生物制备方法技术

本发明专利技术提供了一种贻贝黏蛋白的生物制备方法，包括将蛋白序列rMAP‑3、rMAP‑5分别克隆至表达载体pET22b(+)，再转化进BL21(DE3)感受态细胞；涂布于LB‑Amp培养基上37℃培养及逐级扩大培养，再接种于不含Amp的LB培养基中生长至OD

【技术实现步骤摘要】
一种贻贝黏蛋白的生物制备方法
本专利技术涉及黏蛋白制备
，具体地说，本专利技术涉及一种用于贻贝黏蛋白的生物制备方法。
技术介绍
贻贝是海洋养殖业中的重要种类，中国是全球最大的贻贝生产国，占全球年产的1/4。紫贻贝在全球范围内广泛养殖。它的足丝腺分泌贻贝粘蛋白，形成强韧的蛋白丝，使贻贝固定于海水下的任何表面上，耐受风浪的冲击。其海洋来源表现了两个重要特点，一是隔水粘附：在海水中粘附于固体表面；二是耐受海水：形成粘附之后，耐受海水经年的冲刷。贻贝足丝蛋白的获取方法主要有以下三种手段：(1)直接从贻贝足腺中提取天然黏附蛋白成分，例如，瑞典Biopolymers公司自20世纪80年代开始直接贻贝足腺中提取并研制成组织培养用的粘合剂产品“Cell-Tak”，该产品主要是Mefp-1、Mefp-2和Mefp-3的混合物，可用于细胞培养过程中非贴壁细胞与培养皿的黏附。但由于贻贝足丝蛋白的分泌量很低，1万个贻贝也只能提取1mg的粘附蛋白，导致这种直接提取的黏合剂产品价格昂贵，美国售价达到115美元/mg。(2)由于组织提取方法成本高，学者们展开了基因工程手段生产贻贝粘蛋白的研究。如J.H.Waite等在1999年报道了将紫贻贝Mefp-3基因转入酿酒酵母中进行表达[2]；DongSooHwang等于2004年报道了地中海贻贝的Mefp-5在大肠杆菌中的表达，重组的Mefp-5蛋白具有较好的粘结性能，有可能用于医疗及防水黏合剂的开发。韩国浦项工业大学(POSTECH)的DongSooHwang等将地中海贻贝的mfp-5和mfp-3在大肠杆菌中的表达，得到重组的mfp-5和mfp-3蛋白生物化学粘合剂，以用于医疗及防水黏合剂的开发[3]。粘着蛋白原在贻贝足腺细胞中被合成时经历了复杂的糖基化修饰、羟基化修饰及交联反应，而利用基因工程途径所得到的粘着蛋白产物则缺少这种严格而充分的修饰和加工过程。尽管学者们在体外对其进行了部分糖基化修饰，但所添加的寡糖链的数量、羟基化以及交联程度与天然蛋白质相比均相差甚远，致使所得蛋白产物的粘度远远不及天然蛋白质。由于贻贝黏蛋白结构特殊，溶解困难，溶解度低，导致一般的重组表达方案均无法获得理想效果；而少数重组方案又严重依赖昂贵的仪器设备，产率极低，成本高昂，无法满足后续研究和产业化的需求。(3)由于利用基因工程途径无法获取理想粘度的粘着蛋白产品，因此，贻贝足腺细胞的体外培养与建系研究便成为获取理想粘着蛋白产物的充满希望的开发途径，帮而引起了学术界的广泛关注，早在20年前美国就率先开始了贻贝足腺细胞的体外培养研究，但由于无脊椎动物细胞培养困难，其培养仍属世界性难题，贻贝足腺细胞的传代培养及其建系一直未能成功。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的缺陷，提供了一种贻贝黏蛋白的生物制备方法，能更高效，成本更低的制备的贻贝粘蛋白。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种贻贝黏蛋白的生物制备方法，所述贻贝黏蛋白的生物制备方法包括如下步骤：(1)克隆：将蛋白序列rMAP-3、rMAP-5分别按照大肠杆菌密码子偏好设计如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的基因序列；将所述基因序列分别克隆至表达载体pET22b(+)中，以得到含有重组蛋白序列的表达载体；(2)表达：将所述含有重组蛋白序列的表达载体转化表达宿主E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于LB-Amp平板培养基上，以37℃进行培养；挑取单菌落以LB-Amp平板培养基逐级扩大培养，最终接种于不含Amp的LB培养基中，生长至OD600>6.0后，加入终浓度1mMIPTG诱导，以37℃表达5hrs，10000rpm离心10min，收集菌体；(3)纯化：(3-1)每1克步骤(2)中得到的所述菌体以10-15ml缓冲液A重悬，高压匀浆机破损，10000rpm离心30min，收集得到第一次沉淀；所述缓冲液A为包含以下成分的水溶液：三羟甲基氨基甲烷(Tris)、谷胱甘肽(GSH)、和氯化钠(NaCl)；(3-2)每1克所述第一次沉淀以10-15ml缓冲液B重悬，10000rpm离心30min，收集沉淀，重复一次，得到第二次沉淀；所述缓冲液B为包含以下成分的水溶液：三羟甲基氨基甲烷(Tris)、谷胱甘肽(GSH)、氯化钠(NaCl)、和尿素(Urea)；(3-3)每1克所述第二次沉淀以10-15ml缓冲液C重悬，10000rpm离心30min，收集沉淀，重复四次，得到第三次沉淀；所述缓冲液C为包含以下成分的水溶液：醋酸(HAc)、谷胱甘肽(GSH)、和聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)；(3-4)每1克所述第三次沉淀以10-15ml缓冲液D重悬，10000rpm离心30min，收集沉淀，重复一次，获得蛋白纯度>90％的包涵体；所述缓冲液D为包含以下成分的水溶液：醋酸(HAc)、谷胱甘肽(GSH)、和M甘氨酸(Glycine)；(3-5)每1克所述包涵体以少量纯水重悬，加入12.5ml缓冲液E充分混匀，加入2.5ml缓冲液F混匀，所述包涵体溶解，以纯水定容至100ml，10000rpm离心30min取上清，获得蛋白溶液；所述缓冲液E为包含以下成分的水溶液：醋酸(HAc)和尿素(Urea)；所述缓冲液F为包含十二烷基硫酸钠(SDS)的水溶液；(4)保存：将步骤(3)中得到的所述蛋白溶液进行过滤除菌，并在10℃下保存。作为对本专利技术所述的贻贝黏蛋白的生物制备方法的进一步说明，优选地，所述缓冲液A为包含以下成分的水溶液：20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、20mM谷胱甘肽(GSH)、和50mM氯化钠(NaCl)；所述缓冲液A的pH为6.0。作为对本专利技术所述的贻贝黏蛋白的生物制备方法的进一步说明，优选地，所述缓冲液B为包含以下成分的水溶液：20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、20mM谷胱甘肽(GSH)、50mM氯化钠(NaCl)、和4M尿素(Urea)；所述缓冲液B的pH为6.0。作为对本专利技术所述的贻贝黏蛋白的生物制备方法的进一步说明，优选地，所述缓冲液C为包含以下成分的水溶液：20mM醋酸(HAc)、20mM谷胱甘肽(GSH)、和1％(g/mL)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-100)；所述缓冲液C的pH为5.0。作为对本专利技术所述的贻贝黏蛋白的生物制备方法的进一步说明，优选地，所述缓冲液D为包含以下成分的水溶液：20mM醋酸(HAc)、20mM谷胱甘肽(GSH)、和20mM甘氨酸(Glycine)；所述缓冲液D的pH为4.0。作为对本专利技术所述的贻贝黏蛋白的生物制备方法的进一步说明，优选地，所述缓冲液E为包含以下成分的水溶液：80mM醋酸(HAc)和8M尿素(Urea)；所述缓冲液E的pH为4.0。作为对本专利技术所述的贻贝黏蛋白的生物制备方法的进一步说明，优选地，所述缓冲液F为包含10％(g/mL)十二烷基硫酸钠(SDS)的水溶液。本专利技术的有益效果如下：通过本专利技术的贻贝黏蛋白的生物制备方法所制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种贻贝黏蛋白的生物制备方法，其特征在于，所述贻贝黏蛋白的生物制备方法包括如下步骤：/n(1)克隆：将蛋白序列rMAP-3、rMAP-5分别按照大肠杆菌密码子偏好设计如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示的基因序列；将所述基因序列分别克隆至表达载体pET22b(+)中，以得到含有重组蛋白序列的表达载体；/n(2)表达：将所述含有重组蛋白序列的表达载体转化表达宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于LB-Amp平板培养基上，以37℃进行培养；挑取单菌落以LB-Amp平板培养基逐级扩大培养，最终接种于不含Amp的LB培养基中，生长至OD

【技术特征摘要】
1.一种贻贝黏蛋白的生物制备方法，其特征在于，所述贻贝黏蛋白的生物制备方法包括如下步骤：
(1)克隆：将蛋白序列rMAP-3、rMAP-5分别按照大肠杆菌密码子偏好设计如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的基因序列；将所述基因序列分别克隆至表达载体pET22b(+)中，以得到含有重组蛋白序列的表达载体；
(2)表达：将所述含有重组蛋白序列的表达载体转化表达宿主E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于LB-Amp平板培养基上，以37℃进行培养；挑取单菌落以LB-Amp平板培养基逐级扩大培养，最终接种于不含Amp的LB培养基中，生长至OD600>6.0后，加入终浓度1mMIPTG诱导，以37℃表达5hrs，10000rpm离心10min，收集菌体；
(3)纯化：
(3-1)每1克步骤(2)中得到的所述菌体以10-15ml缓冲液A重悬，高压匀浆机破损，10000rpm离心30min，收集得到第一次沉淀；所述缓冲液A为包含以下成分的水溶液：三羟甲基氨基甲烷、谷胱甘肽、和氯化钠；
(3-2)每1克所述第一次沉淀以10-15ml缓冲液B重悬，10000rpm离心30min，收集沉淀，重复一次，得到第二次沉淀；所述缓冲液B为包含以下成分的水溶液：三羟甲基氨基甲烷、谷胱甘肽、氯化钠、和尿素；
(3-3)每1克所述第二次沉淀以10-15ml缓冲液C重悬，10000rpm离心30min，收集沉淀，重复四次，得到第三次沉淀；所述缓冲液C为包含以下成分的水溶液：醋酸、谷胱甘肽、和聚乙二醇辛基苯基醚；
(3-4)每1克所述第三次沉淀以10-15ml缓冲液D重悬，10000rpm离心30min，收集沉淀，重复一次，获得蛋白纯度>90％的包涵体；所述缓冲液D为包含以下成分的水溶液：醋酸、谷胱甘肽、和M甘氨酸；
(3-5)每1克所述包涵体以少量纯水重悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：阙彩平，杨楠，陈娟，
申请(专利权)人：厦门绥之科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35