一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法技术

本发明专利技术涉及医用动物培育技术领域，且公开了一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，包括以下步骤：S1：血干细胞的培养；S2：干细胞活性物的制备；按1：1：1比例将上述A、B和血吸虫血细胞混合，得到血干细胞活性物；S3：将成年SD雄性大鼠进行喂养培养；S4：喂养1周，测定体重后的大鼠开始投喂高脂CDAA饲料，并注射血干细胞活性物；通过将血干细胞、干细胞活性物和血吸虫混合形成复合因子，注射至健康SD雄性大鼠内，这种大鼠制成的动物模型符合NASH向HCC转化的病理过程，易操作、用时短、稳定有效，为研制和开发治疗非酒精性脂肪性肝炎的新药提供造模和技术支持，有巨大的经济和社会效益。

【技术实现步骤摘要】
一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法
本专利技术涉及医用动物培育
，具体为一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法。
技术介绍
肝纤维化是一个病理生理过程，是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生。任何肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都有肝纤维化的过程，如果损伤因素长期不能去除，纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化。因此它不是一个独立的疾病；复合因子就是多个功能或来源相关的因子的总称。目前用于研究NASH、肝纤维化、肝硬化、HCC的造模动物主要有化学毒物诱导、物理损伤、病理性饮食、基因敲除等。这些技术均存在着以下问题：(1)化学毒物诱导是将DEN或四氯化碳(CCl4)经消化道、腹腔注射诱导大鼠或小鼠，致使肝细胞急性或慢性损伤，导致肝纤维化、肝硬化和肝癌形成，虽然可以诱导肝癌发生，但无法完全模拟人类从单纯性脂肪肝、NASH到HCC的自然演变过程，不具备NASH-HCC研究和新药开发所需的基本模型参数。(2)物理损伤造模是将大鼠或小鼠的肝胆管人为结扎，导致机械性肝内胆汁淤积，引起肝脏进行性损伤、肝纤维化、肝硬化、肝癌形成。但其造模通常用于肝纤维化、肝硬化的基础研究和药物研发，仍不适合NASH-HCC研究和新药开发所需的基本模型参数。(3)病理性饮食诱导造模是通过高脂、胆碱缺乏、高果糖饮食饲养大鼠或小鼠，诱导脂肪肝、NASH和HCC形成。该模型虽然接近人类NASH-HCC的病理过程，但周期长，不是所有动物最终都会出现HCC，观察需要约大于24个月时间，不利于实验研究。(4)基因敲除诱导肝癌造模是通过敲除抑癌基因联合。该种造模可以形成脂肪肝、肝纤维化、NASH和HCC，但是基因敲除方法成本昂贵，且不易操作，不利于实验顺利进行。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，具备易操作，用时短的优点，解决了不易操作的问题。(二)技术方案为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，包括以下步骤：S1：血干细胞的培养采用肠道血加入PBS稀释，取50ml离心管加入10ml淋巴细胞分离液，缓慢加入稀释的肠道血，将分层中间白色云雾状的淋巴细胞层缓慢吸出，加入PBS，离心5分钟，离心后弃上清，再次加入胎牛血清，混匀，重复离心一次；弃上清，加入培养基，混匀后置于100cm2的培养瓶中培养；S2：干细胞活性物的制备取培养的干细胞消化计数，胎牛血清洗涤3次，溶于30ml生理盐水中，超声破碎细胞；使细胞内的蛋白及营养成分充分溶出，10分钟离心后取上清，去掉细胞碎片，超滤膜浓缩，去掉免疫球蛋-白，取过滤液，用滤膜过滤无菌，定浓度为200μg/ml，4℃保存，得A液；培养细胞用的测培养基的PH值为5.5时的上层培养液30ml，用滤膜过滤，使其体积浓缩至5ml左右取出，加入5ml生理盐水，定容至10ml；用0.22μm的滤膜过滤，使其无菌，测蛋白浓度，定浓度为200μg/ml，4℃保存，得B液；按1：1：1比例将上述A、B和血吸虫血细胞混合，得到血干细胞活性物；S3：将成年SD雄性大鼠进行喂养培养；S4：喂养1周，测定体重后的大鼠开始投喂高脂CDAA饲料，并注射血干细胞活性物，一周内其中2天为注射血干细胞活性物，另5天为普通饮水，连续培育8周；S5：饲养期间每天观察大鼠精神状态、毛发情况，测量进食量和饮水量，每周测量大鼠体重，从第一次投喂高脂CDAA饮食和注射血干细胞活性物开始计算，连续培育饲8周，即得到肝纤维化的大鼠。优选的，S3中还包括将SD雄性大鼠置于室温25-30℃、湿度55％-65％的笼子中，在12小时的光照/黑暗周期，适应性喂养1周，测定大鼠体重。优选的，S4中的高脂CDAA饲料，其中，以重量计：脂肪32％、碳水化合物55％、蛋白质13％，胆碱为0；碳水化合物为淀粉、糊精、糖、蛋白质为氨基酸预混料，脂肪为玉米油和氢化植物油，热量为4.3千卡/g。优选的，所述S1中还包括以下步骤：S11：细胞生长到80-90％培养瓶底时，吸出培养基，加入PBS冲洗，吸出PBS，加入胰酶，加入含20％胎牛血清的α-MEM培养基，中和胰酶，吸出中和液，放入离心管中，加入PBS，离心5分钟，离心后去上清，加入PBS，混匀，重新离心一次，细胞计数，每瓶加入2×105细胞，置入100cm2的培养瓶中培养。优选的，还包括S5：利用SD雄性大鼠肝穿刺组织标本在未经任何化学特殊染色的情况下，直接给予胶原特异性激发光谱直接激发离体肝组织，利用荧光显微镜的特殊荧光激发块系统观察肝组织固有荧光特征，而做出肝纤维化程度的诊断。优选的，其特征在于：S5中的特殊荧光激发块激发光波长分布在较低范围300nm-460nm之间内，用于肝纤维化诊断的肝组织切片是未进行任何染色的肝组织切片。优选的，其特征在于：所述肝纤维化诊断系统是针对肝组织切片包括冰冻切片、石蜡包埋切片，在未经过任何化学染色或荧光标记的情况下，在较低波长范围300nm-460nm之间的滤光片，或其他相应光源的激发光激发后所产生的肝组织固有荧光。优选的，S5中的肝纤维化诊断系统包括任何借助于该波长范围在300nm-460nm之间及肝组织标本的固有荧光特征，进行肝纤维化程度判定。(三)有益效果与现有技术相比，本专利技术提供了一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，具备以下有益效果：该采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，通过将血干细胞、干细胞活性物和血吸虫混合形成复合因子，注射至健康SD雄性大鼠内，这种大鼠制成的动物模型符合NASH向HCC转化的病理过程，易操作、用时短、稳定有效，为研制和开发治疗非酒精性脂肪性肝炎的新药提供造模和技术支持，有巨大的经济和社会效益。附图说明图1为本专利技术结构示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1，一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，包括以下步骤：S1：血干细胞的培养采用肠道血加入PBS稀释，取50ml离心管加入10ml淋巴细胞分离液，缓慢加入稀释的肠道血，将分层中间白色云雾状的淋巴细胞层缓慢吸出，加入PBS，离心5分钟，离心后弃上清，再次加入胎牛血清，混匀，重复离心一次；弃上清，加入培养基，混匀后置于100cm2的培养瓶中培养；S2：干细胞活性物的制备取培养的干细胞消化计数，胎牛血清洗涤3次，溶于30ml生理盐水中，超声破碎细胞；使细胞内的蛋白及营养成分充分溶出，10分钟离心本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1：血干细胞的培养/n采用肠道血加入PBS稀释，取50ml离心管加入10ml淋巴细胞分离液，缓慢加入稀释的肠道血，将分层中间白色云雾状的淋巴细胞层缓慢吸出，加入PBS，离心5分钟，离心后弃上清，再次加入胎牛血清，混匀，重复离心一次；弃上清，加入培养基，混匀后置于100cm

【技术特征摘要】
1.一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：血干细胞的培养
采用肠道血加入PBS稀释，取50ml离心管加入10ml淋巴细胞分离液，缓慢加入稀释的肠道血，将分层中间白色云雾状的淋巴细胞层缓慢吸出，加入PBS，离心5分钟，离心后弃上清，再次加入胎牛血清，混匀，重复离心一次；弃上清，加入培养基，混匀后置于100cm2的培养瓶中培养；
S2：干细胞活性物的制备
取培养的干细胞消化计数，胎牛血清洗涤3次，溶于30ml生理盐水中，超声破碎细胞；使细胞内的蛋白及营养成分充分溶出，10分钟离心后取上清，去掉细胞碎片，超滤膜浓缩，去掉免疫球蛋-白，取过滤液，用滤膜过滤无菌，定浓度为200μg/ml，4℃保存，得A液；
培养细胞用的测培养基的PH值为5.5时的上层培养液30ml，用滤膜过滤，使其体积浓缩至5ml左右取出，加入5ml生理盐水，定容至10ml；用0.22μm的滤膜过滤，使其无菌，测蛋白浓度，定浓度为200μg/ml，4℃保存，得B液；
按1：1：1比例将上述A、B和血吸虫血细胞混合，得到血干细胞活性物；
S3：将成年SD雄性大鼠进行喂养培养；
S4：喂养1周，测定体重后的大鼠开始投喂高脂CDAA饲料，并注射血干细胞活性物，一周内其中2天为注射血干细胞活性物，另5天为普通饮水，连续培育8周；
S5：饲养期间每天观察大鼠精神状态、毛发情况，测量进食量和饮水量，每周测量大鼠体重，从第一次投喂高脂CDAA饮食和注射血干细胞活性物开始计算，连续培育饲8周，即得到肝纤维化的大鼠。


2.根据权利要求1所述的一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，其特征在于：S3中还包括将SD雄性大鼠置于室温25-30℃、湿度55％-65％的笼子中，在12小时的光照/黑暗周期，适应性喂养1周，测定大鼠体重。


3.根据权利要求2所述的一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，其特征在于：S4中的高脂CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨振亚，
申请(专利权)人：昕慕上海科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31