一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法技术

本发明专利技术公开了一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法，属于生物技术领域。本发明专利技术公开的一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法，细胞反应板可提前制备，可在‑20℃长期保存；反应结果可用荧光显微镜进行观察。IPMA检测具有特异性强、敏感性高、操作简单的特点；且IPMA方法利用活病毒接种，使用的是全病毒，抗原结构更加完整，结果更具有准确性和代表性。

【技术实现步骤摘要】
一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法
本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2,PCV2)是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)的主要病原，PCV2感染后在猪体内引起免疫抑制，常与猪许多病原并发或继发感染，增加了其防制难度。PCV2相关性疾病(porcinecircovirusassociateddisease,PCVAD)是一组复杂的、多因子疾病，包括PMWS、猪皮炎与肾病综合症(PDNS)、猪呼吸道综合症(PRDC)等等。目前，对PCVAD的诊断标准、致病机理以及针对病毒本身和PCVAD的防制研究还不十分清楚。基于此，建立快速准确的诊断方法和研究其感染机制对PCV2的综合防控具有重要意义。因此，提供一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种PCV2的IPMA(免疫过氧化物酶细胞单层试验)中和抗体检测方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法，具体步骤如下：(1)将PK15细胞消化离心后制备成含1.0×105cells/mL的细胞悬液，每孔100μL铺到96孔板上，置于37℃5％CO2培养箱中培养12h，待细胞完全贴壁，将等体积的PCV2病毒液和临床血清37℃孵育1h，然后接种到96孔板内的PK15细胞上，培养48h待细胞长满后取出96孔板；同时设立正常接毒细胞对照孔；(2)用预冷的无水乙醇固定，加入预冷的无水乙醇，每孔50μL，-20℃放置30min；弃去无水乙醇，PBST清洗，拍干；(3)加入5％的脱脂奶粉进行封闭，每孔200μL，37℃温箱放置2h；PBST清洗，拍干；(4)加入PCV2阳性抗体，用PBS按照1:400稀释，每孔加入50μL，37℃温箱放置1h；PBST清洗，拍干；(5)加入羊抗猪IgG-HRP，用PBS按照1:1000稀释，每孔加入50μL，37℃温箱放置1h，PBST清洗；最后每孔加入PBST50μL，DAB显色5min，终止反应，在倒置荧光显微镜进行观察。进一步，所述PCV2病毒液的制备方法如下：将临床采集的病料组织进行研磨，按照1mg组织样品加入1mLPBS溶解，反复冻融3次，取上清；12000rpm离心5min，用0.22μm滤器过滤，获得PCV2病毒液。进一步，所述临床血清的制备方法如下：将采集的血液进行离心，收集血清，用于后期临床血清检测。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法，细胞反应板可提前制备，可在-20℃长期保存；反应结果可用荧光显微镜进行观察。IPMA检测具有特异性强、敏感性高、操作简单的特点；且IPMA方法利用活病毒接种，使用的是全病毒，抗原结构更加完整，结果更具有准确性和代表性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术PCR扩增结果；其中，M，DL2000；1，PCV2扩增产物；2，阴性对照；图2附图为本专利技术IPMA检测PCV2中和抗体的显色结果；其中，A为中和抗体试验，B为正常接毒细胞对照。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。在猪场采集血液样品和疑似PCV2感染的淋巴结等病料组织，将采集的血液进行离心，收集血清，用于后期临床血清检测。病料组织进行研磨，检测PCV2病毒并分离病毒。细胞株为PK15细胞，PCV2阳性抗体(由实验室保存)。实施例1PCV2病毒分离及鉴定根据GenBank(序列号：FJ667592.1)中PCV2基因序列，设计引物，扩增长度为600bp，具体引物序列如下：PCV2-F：5’-gatctcaaggacaacggagt-3’；SEQIDNO.1；PCV2-R：5’-catatggaaattcagggcatgg-3’；SEQIDNO.2。将临床采集的淋巴结等病料组织进行研磨，按照1mg组织样品加入1mLPBS溶解，反复冻融3次，取上清，然后12000rpm离心5min，用0.22μm滤器过滤，获得PCV2病毒液。取1mL病毒液接种PK15细胞，待病毒增殖48h后，反复冻融3次，收集病毒液，12000rpm离心10min，取上清，根据宝生物DNA提取试剂盒提取PCV2DNA。进行PCR扩增，体系为25μL：DNA模板1μL，PCV2-F0.5μL，PCV2-R0.5μL，ExTaq酶12.5μL，双蒸水10.5μL。混合后放入PCR仪扩增，反应条件为：98℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，进行30个循环；之后72℃再延伸10min，结束后4℃保存。并进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。图1结果显示，目的片段大小约为600bp，宝生物测序结果与预期结果一致；说明病料中含有PCV2。实施例2临床中和抗体检测方法的建立将PK15细胞消化离心后制备成含1.0×105cells/mL的细胞悬液，每孔100μL铺到96孔板上，置于37℃5％CO2培养箱中培养12h，待细胞完全贴壁，将等体积的PCV2病毒液(50μL)和临床血清37℃孵育1h，然后接种到96孔板内的PK15细胞上，培养48h待细胞长满后取出96孔板；同时设立正常接毒细胞对照孔；用预冷的无水乙醇固定，加入预冷的无水乙醇，每孔50μL，-20℃放置30min。然后取出，弃去无水乙醇，PBST清洗5遍，拍干，加入5％的脱脂奶粉进行封闭，每孔200μL，37℃温箱放置2h。PBST清洗5遍，拍干，加入PCV2阳性抗体(按照IDEXX试剂盒检测方法，临床分离获得的PCV2阳性抗体)，用PBS按照1:400稀释，每孔加入50μL，37℃温箱放置1h。PBST清洗5遍，拍干，加入羊抗猪IgG-HRP，用PBS按照1:1000稀释，每孔加入50μL，37℃温箱放置1h，PBST清洗5遍，最后每孔加入PBST50μL，DAB显色5min，终止反应，在倒置荧光显微镜进行观察。IPMA结果判定：PCV2未被血清中和而感染的细胞核或胞浆呈红棕色着染，即为阴性(如图2B)，而被中和未感染的不能着染，即为阳性(如图2A)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法，其特征在于，具体步骤如下：/n(1)将PK15细胞消化离心后制备成含1.0×10

【技术特征摘要】
1.一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将PK15细胞消化离心后制备成含1.0×105cells/mL的细胞悬液，每孔100μL铺到96孔板上，置于37℃5％CO2培养箱中培养12h，待细胞完全贴壁，将等体积的PCV2病毒液和临床血清37℃孵育1h，然后接种到96孔板内的PK15细胞上，培养48h待细胞长满后取出96孔板；同时设立正常接毒细胞对照孔；
(2)用预冷的无水乙醇固定，加入预冷的无水乙醇，每孔50μL，-20℃放置30min；弃去无水乙醇，PBST清洗，拍干；
(3)加入5％的脱脂奶粉进行封闭，每孔200μL，37℃温箱放置2h；PBST清洗，拍干；
(4)加入PCV2阳性抗体，用PBS按照1:400稀释，每孔加入50μL，37℃温箱放...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兴友，王利平，李鹏，刘长忠，魏小兵，孙国鹏，岳锋，王选年，李红，张艳芳，
申请(专利权)人：新乡学院，
类型：发明
国别省市：河南;41