BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用、具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法技术

本发明专利技术属于油菜分子育种技术领域，尤其涉及BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用、具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对BnaSVP基因靶向突变，通过多代自交分离，获得不同拷贝突变组合的纯合突变体。通过两个世代不同地区对获得的纯合突变体进行开花期调查发现，与野生型相比，四个拷贝纯合突变体的开花期提前最多，在两个地区分别提前了40.57％和50.71％。其他不同拷贝组合突变的纯合突变体的开花期产生不同程度的开花期提前的现象，结果证明BnaSVP基因调控开花期的提前存在突变拷贝数量的累加效应。本发明专利技术为油菜花期调控的遗传改良提供重要的功能基因和育种材料。

【技术实现步骤摘要】
BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用、具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法
本专利技术属于油菜分子育种
，尤其涉及BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用、具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法。
技术介绍
油菜不仅可以为人类提供食物油来源，而且也可以为动物提供丰富的蛋白质饲料，与此同时，油菜在工业生产上也起着十分重要的作用，因此，在农业生产中，油菜是一种必不可少的油料作物。油菜的开花期为农业生产上重要的农艺性状之一，合适的开花时间和开花周期可以使油菜的成熟期保持良好的一致性，进而在机械化收获过程中使机械化收获效率增加。开花时间是由一个复杂的遗传网络控制的，该遗传网络整合了许多内源性信号和环境刺激，例如春化、温度、光周期、赤霉素等。甘蓝型油菜来源于甘蓝和白菜之间的自然杂交，是与拟南芥亲缘关系最近的农作物品种之一。截至目前为止，拟南芥中鉴定出了300多个与花期调控相关的基因，并且发现了控制开花期的各种途径中的许多关键调控因子。例如，FRIGIDA(FRI)，FLOWERINGLOCUSC(FLC)和SHORTVEGETATIVEPHASE(SVP)是控制春化反应的必需基因，而CONSTANS(CO)基因在响应光周期反应过程中发挥至关重要的作用。另外还有FLOWERINGLOCUSD(FLD)，FLOWERINGLOCUSCA(FCA)和FLOWERINGLOCUSKHDOMAIN(FLK)等一些基因可以通过抑制FLC基因的表达来促进花期的转变。在花期调控的ABCDE模型中，花发育的早期阶段，SVP和AGAMOUS-LIKE24AGL24基因与APETALA1(AP1)相互作用，通过抑制B类PISTILLAT(API)和(AP3)、C类AGAMOUS(AG)和E类SEPALLATA1(SEP1)、SEP2、SEP3和SEP4基因来保证花期的精准调控。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用、具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本专利技术靶向甘蓝型油菜BnaSVP基因的四个同源拷贝，快速高效的获得了能稳定遗传的具有不同开花期的甘蓝型油菜种质资源，对油菜早熟品种的选育具有重要的意义。该突变体不含有T-DNA插入，和野生型相比，开花期显著提前。本专利技术是这样实现的，BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用，所述BnaSVP基因的四个拷贝的核苷酸序列分别为：SEQIDNO.1所示的BnaA09.SVP，SEQIDNO.2所示的BnaA04.SVP，SEQIDNO.3所示的BnaC08.SVP，SEQIDNO.4所示的BnaC04.SVP。进一步地，所述BnaA09.SVP的氨基酸序列见SEQIDNO.5，所述BnaA04.SVP的氨基酸序列见SEQIDNO.6，所述BnaC08.SVP的氨基酸序列见SEQIDNO.7，所述BnaC04.SVP的氨基酸序列见SEQIDNO.8。本专利技术还提供了具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法，克隆如上所述的BnaSVP的基因组序列，利用CRISPR/CAS9技术靶向BnaSVP的四个同源拷贝，获得突变体，所述突变体材料由所述的BnaSVP的同源拷贝中BnaA09.SVP的单拷贝突变，BnaA09.SVP和BnaC04.SVP两个拷贝同时突变，BnaA09.SVP和BnaC08.SVP两个拷贝同时突变，BnaA04.SVP、BnaA09.SVP和BnaC08.SVP三个拷贝同时突变，及BnaSVP的四个拷贝同时突变所产生的基因编码区内的核苷酸序列突变获得。进一步地，所获突变体单株为：BnaSVP17-5aa1aa2cc1cc2、BnaSVP29-3aa1aa2CC1cc2、BnaSVP52-11aa1aa2cc1cc2、BnaSVP48-3AA1aa2cc1CC2、BnaSVP38-5AA1aa2CC1cc2、BnaSVP25-8AA1aa2CC1CC2。本专利技术还提供了获取如上述的突变体单株的方法，包括以下步骤：步骤1：获取BnaSVP基因片段；步骤2：针对BnaSVP基因的核苷酸序列设计sgRNA，并构建载体；步骤3：将步骤2中构建的载体转化至油菜株系中，获得突变体油菜株系；步骤4：对突变体油菜株系进行检测并测序，确定株系基因型；步骤5：获得的突变体油菜株系种植并自交分离，获得BnaA09.SVP的单拷贝突变，BnaA09.SVP和BnaC04.SVP两个拷贝同时突变，BnaA09.SVP和BnaC08.SVP两个拷贝同时突变，BnaA04.SVP、BnaA09.SVP和BnaC08.SVP三个拷贝同时突变，及BnaSVP的四个拷贝同时突变的突变体材料；步骤2中设计四个sgRNA，其中S1，S2，S3靶向BnaA04.SVP拷贝，S1，S2，S4靶向BnaA09.SVP，BnaC04.SVP和BnaC08.SVP拷贝。进一步地，步骤2中运用pYLCRIPSR/Cas9多重基因组靶向载体系统构建载体。进一步地，步骤3中用农杆菌介导的下胚轴遗传转化方法将构建好的载体转入半冬性甘蓝型油菜纯系J9707中。进一步地，步骤5中获得的一系列纯合突变体的核苷酸序列见。进一步地，获得的纯合突变体的sgRNA序列为：BnaSVP17-5aa1aa2cc1cc2S1ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGGwta1ATGAGAGGAGAGGA----CAAGG-4bpS2CCGTTC--TCTGCGACGCTGATGTTwta2-1CCGTTCT-TCTGCGACGCTGATGTT+Ac1-1CCGTTCTATCTGCGACGCTGATGTT+2bpc1-2CCGTTC------CGACGCTGATGTT-4bpc2-1CCGTTCT-TCTGCGACGCTGATGTT+Tc2-2CCGTTC---CTGCGACGCTGATGTT-TBnaSVP29-3aa1aa2CC1cc2S1ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGGwta1ATGAGAGGAGAGG------AAGG-6bpS2CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTTwta2CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT+Tc2-1CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT+T/58％c2-2CCGTTC-T—GCGACGCTGATGTT-2bp/42％S4CGAGAGAGAAGATTCAG-ATCAGGwta2CGAGAGAGAAGATTCAGTATCAGG+Tc2/--------------------AGG-31bpBnaSVP52-11aa1aa2cc1cc2S1...

【技术保护点】
1.BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用，所述BnaSVP基因的四个拷贝的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.1所示的BnaA09.SVP，SEQ ID NO.2所示的BnaA04.SVP，SEQ ID NO.3所示的BnaC08.SVP，SEQ ID NO.4所示的BnaC04.SVP。/n

【技术特征摘要】
1.BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用，所述BnaSVP基因的四个拷贝的核苷酸序列分别为：SEQIDNO.1所示的BnaA09.SVP，SEQIDNO.2所示的BnaA04.SVP，SEQIDNO.3所示的BnaC08.SVP，SEQIDNO.4所示的BnaC04.SVP。


2.根据权利要求1所述的BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用，其特征在于：所述BnaA09.SVP的氨基酸序列见SEQIDNO.5，所述BnaA04.SVP的氨基酸序列见SEQIDNO.6，所述BnaC08.SVP的氨基酸序列见SEQIDNO.7，所述BnaC04.SVP的氨基酸序列见SEQIDNO.8。


3.具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法，其特征在于：克隆如权利要求1中所述的BnaSVP的基因组序列，利用CRISPR/CAS9技术靶向BnaSVP的四个同源拷贝，获得突变体，所述突变体材料由所述的BnaSVP的同源拷贝中BnaA09.SVP的单拷贝突变，BnaA09.SVP和BnaC04.SVP两个拷贝同时突变，BnaA09.SVP和BnaC08.SVP两个拷贝同时突变，BnaA04.SVP、BnaA09.SVP和BnaC08.SVP三个拷贝同时突变，及BnaSVP的四个拷贝同时突变所产生的基因编码区内的核苷酸序列突变获得。


4.根据权利要求3所述的具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法，其特征在于：
所获突变体单株为：BnaSVP17-5aa1aa2cc1cc2、BnaSVP29-3aa1aa2CC1cc2、BnaSVP52-11aa1aa2cc1cc2、BnaSVP48-3AA1aa2cc1CC2、BnaSVP38-5AA1aa2CC1cc2、BnaSVP25-8AA1aa2CC1CC2。


5.获取如权利要求4中所述的突变体单株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：获取BnaSVP基因片段；
步骤2：针对BnaSVP基因的核苷酸序列设计sgRNA，并构建载体；
步骤3：将步骤2中构建的载体转化至油菜株系中，获得突变体油菜株系；
步骤4：对突变体油菜株系进行检测并测序，确定株系基因型；
步骤5：获得的突变体油菜株系种植并自交分离，获得BnaA09.SVP的单拷贝突变，BnaA09.SVP和BnaC04.SVP两个拷贝同时突变，BnaA09.SVP和BnaC08.SVP两个拷贝同时突变，BnaA04.SVP、BnaA09.SVP和BnaC08.SVP三个拷贝同时突变，及BnaSVP的四个拷贝同时突变的突变体材料；
步骤2中设计四个sgRNA，其中S1，S2，S3靶向BnaA04.SVP拷贝，S1，S2，S4靶向BnaA09.SVP，BnaC04.SVP和BnaC08.SVP拷贝。


6.根据权利要求5所述的获取突变体单株的方法，其特征在于，获得的纯合突变体的sgRNA序列为：
BnaSVP17-5aa1aa2cc1cc2
S1
ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGGwt
a1ATGAGAGGAGAGGA----CAAGG-4bp
S2
CCGTTC--TCTGCGACGCTGATGTTwt
a2-1CCGTTCT-TCTGCGACGCTGATGTT+A

【专利技术属性】
技术研发人员：范楚川，周永明，翟云孤，黄会斌，许磊，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42