本发明专利技术公开了蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术公开了蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600在驱动外源基因在受体植物种子中特异性高水平表达中的应用。转基因拟南芥种子萌发过程及成体植株各组织器官的GUS组织化学染色结果表明，所克隆的编码区上游序列为种子特异性启动子。转基因拟南芥种子的GUS酶活检测结果表明，所克隆启动子驱动GUS的表达量极显著高于CaMV35S启动子，认为其可用于植物基因工程领域，驱动外源基因在转基因植物种子中高水平表达。
【技术实现步骤摘要】
蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其应用
本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其应用。
技术介绍
苜蓿属(Medicago)植物为一年生或多年生草本，其中紫苜蓿(M.sativa)素有“牧草之王”的美称，是全世界公认的重要豆科(Leguminosae)牧草。蒺藜苜蓿为二倍体常自交(predominantlyself-fertilizing)植物，与紫苜蓿亲缘关系较近，作为研究豆科植物-根瘤菌共生体系(legumes-rhizobiasymbiosis)的模式植物，其全基因组测序工作已完成(Brancaetal.,2011；Youngetal.,2011)。种子贮藏蛋白(seedstorageproteins,SSPs)是指高等植物在种子成熟过程中合成并大量储存的贮藏蛋白质，可为种子的萌发过程提供氮源、碳源和硫源。由于具有高度多态性，苜蓿种子贮藏蛋白可用于品种或种质资源间的遗传多样性分析和品种鉴定工作。相对于种子作为人类蛋白质来源的大豆(Glycinemax)、菜豆(Phaseolusvulgaris)等豆科植物而言，苜蓿种子因无食用价值，其种子贮藏蛋白的种类、数量及基因信息鲜有文献报道。Stuart等(1988)采用不同pH值和离子强度的缓冲液提取紫苜蓿种子贮藏蛋白，并进行分离纯化研究，认为其种子贮藏蛋白主要为7S豌豆球蛋白(vicilin)和11S豆球蛋白(legumin)2类，分别含有表观分子量(apparentmolecularweight)为52、36、32、20kD和49、47、45、39、22、20kD的成员。种子贮藏蛋白基因的启动子为种子特异性启动子的潜在来源。因此，提供蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600，其核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。进一步，所述的蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600在驱动外源基因在受体植物种子中特异性高水平表达中的应用。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其应用，种子贮藏蛋白为高等植物种子成熟过程中合成并贮存的大量贮藏蛋白质的总称，其基因的启动子是种子特异性启动子的重要来源。为发掘双子叶植物种子特异性启动子，本专利技术以蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)为试材，克隆其豆球蛋白基因Mt1g072600编码区上游2075bp序列，利用工具网站PLACE和PlantCARE预测顺式作用元件，构建其驱动GUS的植物表达载体并进行拟南芥的遗传转化。结果表明，该编码区上游序列含有E-box、A/Trichelement、P-box等多个种子特异性启动子相关顺式作用元件，命名为PMt1g072600；转基因拟南芥种子(Arabidopsisthaliana)中GUS表达情况分析，发现PMt1g072600驱动GUS的表达量极显著地高于PCaMV35S。转基因拟南芥各组织/器官的组织化学染色结果表明PMt1g072600驱动GUS表现出组织/器官表达的特异性。本专利技术成功克隆了蒺藜苜蓿来源的种子特异性启动子，可用于驱动外源基因在转基因植物种子中表达。本专利技术获得了能够驱动外源基因在受体植物种子中特异性表达的种子特异性启动子，为实现外源基因表达的定时、定位、定量的精确“三维”调控，避免由于与受体植物内源性启动子的同源性而存在转基因沉默风险提供候选启动子资源。本专利技术启动子驱动GUS的表达量极显著地高于PCaMV35S，认为该启动子可应用于种子生物反应器，驱动医药、饲料或工业用酶基因在双子叶植物中高效率表达。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术Mt1g072600编码区上游序列的PCR扩增结果；其中，M:DNA分子量标准；1:Mt1g072600编码区上游序列扩增产物；图2附图为本专利技术Mt1g072600编码区上游序列；其中，方框或下划线示顺式作用元件，+1示转录起始位点；图3附图为本专利技术植物表达载体pEXPR(PMt1g072600::GUS::T35S)示意图；图4附图为本专利技术转基因拟南芥PCR检测的部分结果；其中，M:DNA分子量标准；1-6:转基因拟南芥株系编号；CK:野生型拟南芥阴性对照；图5附图为本专利技术转基因拟南芥种子中GUS酶活；图6附图为本专利技术转基因拟南芥的GUS组织化学染色；其中，A：野生型；B：PCaMV35S；C：PMt1g072600；1：胚；2：3日龄幼苗；3：9日龄幼苗；4：根；5：茎；6：莲座叶；7：茎生叶；8：果瓣；9：花；10：花序；标尺：1mm。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。蒺藜苜蓿R108、拟南芥(Arabidopsisthaliana)Col0种子由本实验室保存。入门载体pENTRY(PCaMV35S::GUS::T35S)、目的载体pEarleyGate303均为本实验室保存。其中，pENTRY(PCaMV35S::GUS::T35S)载体构建过程如下：(1)合成linker-1/2linker-1：AATTCGCCCTTGCGATCGCATGCGACTGCGGCCGCTCAGTGCACCCGGGCATGTCATGGCGCGCCAAGGGCG；SEQIDNO.1；linker-2：AATTCGCCCTTGGCGCGCCATGACATGCCCGGGTGCACTGAGCGGCCGCAGTCGCATGCGATCGCAAGGGCG；SEQIDNO.2；(2)用EcoRI对Invitrogen公司产品(货号：K250020SC)进行酶切。(3)linker-1/2退火形成具有粘性末端的双链后，连入的酶切后载体大片段，命名为pENTR-MCS。(4)用T35S(F)/(R)对pCAMBIA23本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。/n
【技术特征摘要】
1.蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。
【专利技术属性】
技术研发人员：魏琦超，关园园，李东霄，宋普文，徐新娟，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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