一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术的目的之一是提供一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法，包括：体细胞的分离、提取和扩增；基因敲降载体或基因敲除载体的转染；神经干细胞的扩增培养；所述的基因敲降载体或基因敲除载体包括阻断let‑7基因的shRNA、siRNA、CRISPR基因编辑载体或相关microRNA抑制剂。本发明专利技术使用敲降或敲除一个microRNA—let‑7b的表达而不引入任何外源基因，由成纤维胞成功诱导出神经干细胞，可在短时间内扩增产生能够足够移植所需的细胞量，并且是遗传稳定的，能分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，可扩增超过20代以上的神经干细胞，移植给老鼠也未见诱导肿瘤形成。

【技术实现步骤摘要】
一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用。
技术介绍
干细胞技术的发展为许多神经系统疾病治疗带来了希望，包括神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森氏病等，神经损伤性疾病如脊髓损伤，还有肌萎缩性脊髓侧索硬化症、自闭症等。研究表明，使用胚胎干细胞分化形成的神经元治疗阿尔茨海默症、帕金森、脊髓损伤等疾病有一定作用，但胚胎干细胞的来源存在伦理争议，还有致瘤性和免疫排斥作用限制了其应用。由体细胞重编程形成的诱导多能干细胞(iPSCs)，可以解决免疫原性，但面临潜在致瘤性，定向分化效率低等问题。神经干细胞(NSCs)是指一类具有自我复制和自我更新能力，且能高度增殖和进行多向分化的细胞，在研究神经系统发育、分化以及治疗神经系统疾病中具有重要的作用。因此，将体细胞直接重编程为诱导神经干细胞(inducedneuralstemcells，iNSCs)，而不经过iPSCs阶段，从而减少其致瘤性、提高分化效率，成为现在干细胞研究领域中的研究热点。一些研究学者利用几个转录因子进行组合重编程鼠的成纤维细胞诱导生成稳定可扩增的神经干细胞。这些研究对于重编程干细胞形成神经干细胞的策略是可以借鉴的，Thier等利用传统的多能干细胞重编程因子(sox2、oct4等)在最初的重编程过程中限制了OCT4的表达，产生的神经干细胞聚集的神经克隆球能够无限扩增至50代而不改变分子性能，同时这些神经干细胞也能够表达神经细胞特定的表面标志如Nestin和Olig2等。Han等同样用了转录因子的组合(Brn4/Pou3f4,Sox2,Klf4,c-Myc,和E47/Tcf3)直接重编程鼠的成纤维细胞诱导生成神经干细胞，产生的神经干细胞注射到免疫小鼠脑内没有产生畸胎瘤，并且这种细胞具有脑源性神经细胞的分子学特征、分化性能和自我更新的能力。此外体内分化中能够产生神经元体系，而且只有一小部分移植细胞维持神经祖细胞的性能。裴端卿等使用非整合质粒载体携带Oct4,Sox2,Sv40LT,Klf4和microRNA302-367电转入人尿液中提取的活细胞，诱导形成神经干细胞，电转后12天可见神经干细胞克隆出现，但是不能自然分化为少突胶质细胞。总体上，从体细胞转染转录因子诱导神经干细胞，需要较长时间的培养，才能形成神经干细胞克隆，诱导效率也较低。由此可见，现有技术中采用外源基因进行重编程神经干细胞诱导的成功率较低，且病毒转染时可能将外源基因整合到细胞基因组中，导致供体细胞基因突变；此外，诱导得到的神经干细胞体外扩增代数少，体细胞重编程的周期长、重编程效率低，数量上无法满足临床需求，而不适用于脑中风损伤及脊髓损伤这种并非只是单一神经细胞病变的疾病，数量能够满足临床需求。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术存在的不足，提供一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法，并将获得的神经干细胞应用于植被预防和治疗神经系统疾病的药物组合物。本专利技术要解决的技术问题主要在于克服现有技术中重编程体细胞转化效率较低、神经干细胞克隆形成效率低和体细胞转分化的周期长等缺陷，从而提供一种可以利用自身体细胞快速重编程、转分化效率高、转分化时间短的神经干细胞的诱导方法。与此同时，由于现有的转分化重编程方法涉及到外源基因的介入，具有很大的临床安全隐患。因此，本领域迫切需要一种新的不需要外源基因介入的诱导体细胞转分化为神经干细胞将为神经干细胞的方法。具体技术方案如下：本专利技术的目的之一是提供一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法，包括：体细胞的分离、提取和扩增；基因敲降载体或基因敲除载体的转染；神经干细胞的扩增培养；所述的基因敲降载体或基因敲除载体包括阻断let-7基因的shRNA、siRNA或CRISPR基因编辑载体以及相关microRNA抑制剂。所述的let-7基因，包括let-7家族所有的单个成员，优选使用let-7b基因。细胞治疗是利用分离、分化和扩增来的健康细胞移植给患者来代替人体中受损的细胞和组织，从而进行治疗的方法。神经系统遗传性疾病、退行性疾病和损伤性疾病，在患者的体内损失大量的神经细胞，如能补充上足够的神经细胞，则可修复相应的神经损伤。而目前所采取的药物和手术治疗只能延缓疾病恶化而不能彻底治愈。由于神经细胞无法像造血干细胞那样进行捐献，其来源受到极大的限制，没有移植细胞可供治疗用。神经细胞现实的来源主要有从流产胎儿分离的方法，由于受到伦理限制和免疫排斥问题，无法在临床上大规模使用。另一个来源是从胚胎干细胞或诱导多能干细胞尽心分化来获取，存在分化时间长，分化效率低，以及形成潜在肿瘤的可能，以及免疫原性的问题，而在临床研究中受到限制。一个较好来源是直接重编程体细胞来形成神经干细胞，可以快速高效的获取自体神经干细胞，避免免疫排斥和效率低等问题，但由于引入外源基因，这个方法获得的细胞实际上难以用作细胞治疗剂。因此，我们另辟蹊径，不同于在体细胞中过表达神经干细胞相关转录因子以诱导神经干细胞生成的“加法”策略，我们提出“减法”策略，即通过在体细胞中中敲降一个microRNA—let-7来诱导生成神经干细胞，该方法更为简便、安全、易操作，完全解决上述难题。本专利技术的专利技术人做出艰苦的努力，使用敲降一个microRNA—let-7b的表达而不引入任何外源基因，由成纤维胞成功诱导出神经干细胞，结果是，可在短时间内扩增产生能够足够移植所需的细胞量，并且是遗传稳定的，能分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，可扩增超过20代以上的神经干细胞，移植给老鼠也未见诱导肿瘤形成。已经经过实验证明可行，实验经过不下几十次，结果均类似，人和鼠成纤维细胞在转染抑制let-7b的慢病毒载体后，在神经干细胞诱导液的作用下，都能在3-5天获得大量神经干细胞，转染率非常高，神经干细胞克隆形成率远高于现有方法，获得的神经干细胞被免疫荧光和实时定量PCR验证，具有神经干细胞的表面标志和分子标志。通过分化实验，证明具有分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。移植小鼠脑内，证明可在脑内存活、分化，并证明无肿瘤形成。进一步，所述的let-7b基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，具体为UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU；编码所述的shRNA的DNA序列如SEQ.ID.NO.2所示，具体为AACCACACAACCTACTACCTCA。进一步，所述的基因敲降载体或基因敲除载体慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或质粒载体所构建形成的shRNA、RNAi、CRISPR基因编辑载体或相关microRNA抑制剂。进一步，所述的体细胞为成纤维细胞、血液细胞、尿液细胞、上皮细胞、表皮细胞或毛囊细胞。再进一步，所述的成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞、人包皮成纤维细胞、人眼睑成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞或小鼠尾尖成纤维细胞。进一步，所述的基因敲降载体或基因敲除载体的转染为：在神经干细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法，其特征在于，包括：体细胞的分离、提取和扩增；基因敲降载体或基因敲除载体的转染；神经干细胞的扩增培养；/n所述的基因敲降载体或基因敲除载体包括阻断let-7基因的shRNA、siRNA、CRISPR基因编辑载体或相关microRNA抑制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法，其特征在于，包括：体细胞的分离、提取和扩增；基因敲降载体或基因敲除载体的转染；神经干细胞的扩增培养；
所述的基因敲降载体或基因敲除载体包括阻断let-7基因的shRNA、siRNA、CRISPR基因编辑载体或相关microRNA抑制剂。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的let-7基因为let-7b，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；编码所述的shRNA的DNA序列如SEQ.ID.NO.2所示。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的基因敲降载体或基因敲除载体为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或质粒载体所构建形成的shRNA、RNAi、CRISPR基因编辑载体或相关microRNA抑制剂。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的体细胞为成纤维细胞、血液细胞、尿液细胞、上皮细胞、表皮细胞或毛囊细胞。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞、人包皮成纤维细胞、人眼睑成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞或小鼠尾尖成纤维细胞。


6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃嗣，
申请(专利权)人：滨州医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37