一种犬脑钠肽（BNP）单克隆抗体的制备制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域。本发明专利技术涉及一种包含犬脑钠肽（BNP）两个优势抗原表位的多肽，通过用多肽偶联KLH蛋白免疫小鼠来增强免疫效果。本发明专利技术还提供了一种重组蛋白，该重组蛋白包含犬BNP两个优势表位，为提高该重组蛋白在原核表达系统中的产量，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应核苷酸序列，通过化学合成该核苷酸序列并构建重组蛋白表达载体。本发明专利技术还涉及用多肽偶联KLH蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，经淘选筛选得到对应犬BNP单链抗体scfv序列，将得到的scfv序列构建成完整鼠IgG1抗体序列表达载体，通过瞬转HEK293F细胞表达单克隆抗体，纯化单克隆抗体，通过免疫荧光正交实验确定最佳单抗配对组合。

【技术实现步骤摘要】
一种犬脑钠肽(BNP)单克隆抗体的制备
本专利技术属于生物
，具体涉及到一种新的犬脑钠肽(BNP)重组蛋白。还涉及用多肽偶联KLH蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，筛选得到特异性单链抗体scfv序列，还涉及将得到的scfv序列构建成真核表达载体来表达抗犬脑钠肽(BNP)重组蛋白的单克隆抗体，并应用于犬心力衰竭的早期诊断。
技术介绍
心力衰竭(heartfailure)又称心功能不全，它不是一个独立的疾病，往往在其他疾病的发生过程中继发产生，是由于心肌收缩力减弱，心输出的血量不能满足机体的需要，而导致全身出现严重的机能障碍综合症。发病率高，危害大，可分为急性和慢性两种。急性心力衰竭常由心脏一时负荷过重引起。慢性心力衰竭，病情发展缓慢，病程可持续数月或数年。病犬精神沉郁，易疲劳，呼吸困难，黏膜发绀，四肢末端常发生对称性水肿，运动后水肿减轻或消失；脉数细，心音减弱，常可听到心内杂音和心律失常，救治不及时，可因缺氧和休克而死亡。长期以来，诊断宠物心衰除呼吸、脉搏等动物表征以及X线、心电图、超声心动图等影像检查心脏腔体与血管形态结构外，还需检查血常规、血生化、离子、血气等与心功能相关的离子与酶，才能对该病做一全面的评判。然而这些检查不仅相对费时，而且价格昂贵。近年来，脑钠肽(BNP)开始被用于心脏疾病诊断上，这一新的实验室检测指标在心力衰竭临床诊断中的应用受到广泛关注。在发生心脏病时，肾素-血管紧张素-醛固酮系统长期过度刺激，导致心脏过大，容量超负荷和充血性心力衰竭。钠尿肽通过刺激尿钠排泄，增加肾脏血流量，利尿和促进血管扩张及提高心脏舒张功能来拮抗这种作用。循环系统中的心房钠尿肽(心纳素，ANP)和B型钠尿肽(脑钠肽，BNP)水平增加，二者以前体形式释放，然后被酶裂解成有活性C-末端片段(C-ANP和C-BNP)和无活性的N-末端片段(NT-proANP和NT-proBNP)。C-ANP和C-BNP的半衰期极为短暂测量浓度比较困难，NT-proANP和NT-proBNP的半衰期较长且更稳定，有利于收集和样品处理，在临床测定更加可行。因此BNP对于心衰的预防筛查、疗效检测、预后评估等方面均具有广泛应用。目前，免疫学检测方法由于操作简便、省时快速、结果易于判定，已成为市场主流方向。该方法需要制备犬脑钠肽单克隆抗体，常规该单抗制备所使用的免疫原是基因工程技术表达的完整蛋白，由于碱基密码子的缘故，该蛋白在大肠杆菌中表达困难、表达量极低，导致后续纯化工作难以开展，对其单克隆抗体制备有阻碍。还由于抗原表位氨基酸序列同源性缘故，所制得的单克隆抗体特异性差，与其它物种蛋白具有高度同源性，也可导致检测结果失真。另外，传统小鼠腹水制备单克隆抗体制备周期长，不同批次间差异大，且腹水中常混有各种杂蛋白，要提纯后才可以使用。真核系统表达产物加工机制最接近体内天然形式，易保留生物活性，可以对表达产物进行适当修饰和区域分布；还可以用瞬时转染的方式快速灵活的制备单克隆抗体，使得制备周期大大缩短，且其稳定性强，批间差异小。故本专利技术所需单克隆抗体用真核系统表达。
技术实现思路
设计目的：为解决传统小鼠腹水制备单克隆抗体周期长、纯度低、批间差异大的不足，通过设计、合成犬BNP重组蛋白并通过建立噬菌体库和真核细胞表达来制备其单克隆抗体，不仅节省时间，还提高对犬BNP的特异性识别检测。设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以犬脑钠肽(BNP)为靶抗原，分析并选择该抗原两个优势抗原表位，序列比较结果显示所选择的两个抗原表位是所有犬脑钠肽(BNP)共有表位并与其它蛋白序列无明显同源性。(2)通过将所选择的两个优势抗原表位串联并偶联KLH蛋白，用其免疫小鼠，可以有效增强免疫效果并缩短单克隆抗体制备时间。(3)将所选择的两个优势抗原表位序列分别通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后重复，形成重组犬脑钠肽蛋白氨基酸序列。(4)采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，可以提高该重组蛋白在大肠杆菌中的表达量。(5)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET-32a(+),构建犬脑钠肽(BNP)重组蛋白表达载体。(6)犬脑钠肽(BNP)重组蛋白表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，筛选得到重组蛋白表达菌株。(7)重组蛋白表达菌株大规模培养后，经超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化犬脑钠肽(BNP)重组蛋白。(8)用包含犬脑钠肽(BNP)两个优势抗原表位的多肽偶联KLH蛋白来多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏分离淋巴细胞用来建立单链抗体scfv噬菌体展示库，进行多轮淘选筛选最终得到能与犬BNP重组蛋白结合的单链抗体scfv序列。(9)将scfv序列构建成完整鼠IgG1表达载体并使用HEK293细胞表达单克隆抗体，使用ProteinA亲和层析法纯化单克隆抗体，并分别标记荧光微球。(10)正交实验筛选显示4H5单抗包被与6D2单抗标记配对为最佳检测犬脑钠肽(BNP)组合。本专利技术与
技术介绍
相比，一是采用大肠杆菌偏爱密码子优化重组蛋白对应的核苷酸序列，从而大大提高了重组蛋白在大肠杆菌中的表达水平；二是作为免疫原的KLH偶联蛋白仅含有犬脑钠肽(BNP)特有的两个优势抗原表位，既提高了免疫效率，又可以保证最终得到的单克隆抗体仅特异性识别犬脑钠肽(BNP)，提高了检测灵敏度；三是真核表达犬脑钠肽(BNP)单克隆抗体用瞬时转染的方式快速制备单抗，既可以大大缩短制备周期，又经过表面修饰，保证了蛋白的天然活性。具体实施方式以下实施例虽然对本专利技术的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本专利技术设计思路的简单文字描述，而不是对本专利技术设计思路的限制，任何不超出本专利技术设计思路的组合、增加或修改，均落入到本专利技术的保护范围内。实施例1：犬脑钠肽(BNP)优势抗原表位选择以犬脑钠肽(BNP)为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择A优势抗原表位和B优势抗原表位。同时，序列比较结果显示所选择的A、B两个优势抗原表位序列具备广谱性，是所有犬脑钠肽(BNP)的共有表位；并且A、B表位与其它蛋白序列无明显同源性，仅存在于犬脑钠肽(BNP)序列。实施例2：合成含有犬脑钠肽(BNP)优势抗原表位的多肽为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的激活效果以缩短单克隆抗体制备时间，化学合成犬脑钠肽A、B两个优势抗原表位序列并串联，同时在末端连接半胱氨酸(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，得到多肽。实施例3：多肽偶联KLH蛋白将20mgSMCC溶于2mlDMF(二甲基甲酰胺)，将0.8mlKLH加入到25ml圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH7.2)使蛋白终浓度为15mg/ml。将溶解的SMCC溶液缓慢滴加到120mgKLH蛋白体系中，室温搅拌反应1h。用1L1×PBS(PH7.4)溶液于4℃下透析6小时，除去游离的SMCC。将透析后KLH蛋白倒入50ml离心管中，得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗犬脑钠肽重组蛋白特异性单链抗体scfv-4H5，包括轻链和重链，其特征在于：/n所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；/n所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.抗犬脑钠肽重组蛋白特异性单链抗体scfv-4H5，包括轻链和重链，其特征在于：
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.抗犬脑钠肽重组蛋白特异性单链抗体scfv-6D2，包括轻链和重链，其特征在于：
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


3.一种编码权利要求1所述的抗犬脑钠肽重组蛋白特异性单链抗体scfv-4H5的基因，其特征在于：
编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；
编码重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。


4.一种编码权利要求2所述的抗犬脑钠肽重组蛋白特异性单链抗体scFv-6D2的基因，其特征在于：
编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；
编码重链可变区的核苷酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：武戌青，曹丹琴，陈安琪，余铭恩，吴琼杉，
申请(专利权)人：杭州贤至生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33