一种具有免疫耐受功能的胰岛类器官及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种具有免疫耐受功能的胰岛类器官及制备方法和应用。将含胰岛细胞团、间充质干细胞、免疫抑制剂与支架材料按照体积比1:1:0.5:2.5混合，制成水凝胶材料，交联反应1h。本发明专利技术制备的胰岛类器官能很好地解决宿主的免疫排斥反应和早期缺血的问题，胰岛移植物的功能和存活时间得以延长，提高临床胰岛移植的效果，缓解一型糖尿病患者需要长期胰岛素治疗的痛苦。

【技术实现步骤摘要】
一种具有免疫耐受功能的胰岛类器官及制备方法和应用
本专利技术属于生物
，特别是胰岛移植物技术，具体为一种具有免疫耐受功能的胰岛类器官及制备方法和应用。
技术介绍
目前胰岛移植被广泛认为是1型糖尿病最具有潜力和有效的治疗手段，近年已成为倍受关注的研究热点。多中心临床胰岛移植试验证明了胰岛移植短期效果显著，移植后1年脱离胰岛素治疗的成功率高达80％,但不幸的是移植后2年脱离胰岛素的成功率小于15％。宿主的免疫排斥反应和早期缺血是造成胰岛移植物失功的主要原因。为了解决这两个问题，现有用天然或合成水凝胶封装胰岛制备胰岛类器官进行移植的研究。用于封装胰岛的水凝胶支架根据分类标准的不同，有不同的分类方法。按照胰岛的封装量来分类，可以分为大量封装、微量封装和纳米封装。大量封装是将足够当量的胰岛封装在一个较大的移植材料中。但是由于大量封装的表面积与体积之比较低，不利于营养物质和氧气的扩散，而且血糖和胰岛素的交换也将受到影响。大量封装最大的优点是移植后能够将胰岛固定在移植装置中，胰岛不会在移植部位游离，而且移植后也可以取出。微量封装是指每个封装结构直径均低于1mm，在半透膜里面只能包裹上1-2个胰岛细胞团。微量封装克服了大量封装的缺点，所以微量封装移植后的成功率较高。纳米封装指的是在胰岛细胞表面进行层层组装，形成厚度为纳米级别的、具有特定功能的薄膜，从而封装胰岛。纳米封装的优点是纳米薄膜一般对胰岛的存活率不造成影响。另外根据水凝胶支架是否具有免疫屏障作用也可分为胰岛移植免疫隔离系统和胰岛移植免疫开放系统。免疫隔离系统是指在胰岛表面形成一层免疫隔离屏障或者移植到免疫豁免部位，最终可以减弱免疫排斥反应，移植受体可以免于免疫抑制剂的使用。胰岛移植免疫开放系统虽然不能建立起免疫隔离的屏障，但是移植物能与机体进行更好的营养物质交换，移植物的新生血管更容易长入，可以很好地保证胰岛移植物的供氧和功能。现有的胰岛移植物封装技术并不能完全解决胰岛移植后免疫排斥和缺血再灌注损伤的问题，比如可以解决移植物血管重建的问题但却不具有免疫隔离的能力，或者虽然免疫隔离效果很好但致密的封装层没有促进血管生成的设计，最终导致胰岛移植的效果欠佳。
技术实现思路
本专利技术的目的是运用水凝胶作为载体，通过搭载间充质细胞和免疫抑制相关药物，制备一种高度模拟原有微环境的并具有免疫耐受功能的胰岛类器官。将该胰岛类器官移植给糖尿病受体，能解决宿主的免疫排斥反应和胰岛移植物早期缺血的问题，延长移植物的存活，改善移植后血糖控制效果。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种具有免疫耐受功能的胰岛类器官的制备方法，包括将胰岛细胞团、间充质干细胞、免疫抑制剂与支架材料按照体积比1:1:0.5:2.5混合，制成水凝胶材料，交联反应1h即可。一种具有免疫耐受功能的胰岛类器官的制备方法，包括以下步骤：将含胰岛细胞团的培养液与含间充质干细胞的培养液按照体积比1:1充分混合；然后按体积比4.5:4.5:1加入CTLA4-Ig融合蛋白溶液、HMGB1中和抗体溶液和雷帕霉素，得到混合液体；将鼠尾胶原Ⅰ溶液与所述混合液充分混匀；含胰岛细胞团的培养液、含间充质干细胞的培养液、免疫抑制剂混合液与鼠尾胶原Ⅰ溶液的体积比为1:1:0.5:2.5；最后加入NaHCO3或者NaOH调节pH值到中性，交联反应1h。本专利技术制备的胰岛类器官解决宿主的免疫排斥反应和早期缺血的问题，胰岛移植物的功能和存活时间得以延长。进行体内外实验，证实了该胰岛类器官有利于移植物存活和组织内血管新生，明显改善移植物缺血缺氧的凋亡情况，减少了免疫细胞对胰岛组织的破坏和炎性损伤，移植物组织局部可以建立免疫抑制的微环境。通过血糖监测发现，一型糖尿病受体在该胰岛类器官移植后能够快速脱离胰岛素治疗，改善移植受体的血糖控制，显著延长胰岛移植物体内的存活时间，该胰岛类器官移植物体内存活时间高达常规胰岛移植物的3倍以上。相较于现有的胰岛移植封装技术的不足，本专利技术同时解决胰岛移植后缺血和免疫排斥的问题，移植效果得到明显提高。可提高临床胰岛移植的效果，缓解一型糖尿病患者需要长期胰岛素治疗的痛苦。附图说明图1为鼠尾胶原Ⅰ溶液调至中性成胶后的扫描电镜图；图2为实施例2制备的胰岛类器官物扫描电镜图；图3为将胰岛类器官和单纯胰岛分别进行体外培养的荧光染色图；图4为胰岛类器官和单纯胰岛分别与淋巴细胞进行体外混合培养的荧光染色图；图5为胰岛类器官和单纯胰岛移植糖尿病的NOD小鼠体内Treg含量流式分析图；图6为胰岛类器官和单纯胰岛移植糖尿病的NOD小鼠体内动物模型中胰岛存活对比图；图7为胰岛类器官和单纯胰岛移植糖尿病的NOD小鼠体内动物模型中血糖监测对比图。具体实施方式实施例1：所用材料如下：1.含有猪胰岛细胞团的培养液5000个/mL及含有间充质干细胞MSCs的培养液5×105个/mL。2.雷帕霉素(Sigma)2mM；CTLA4-Ig融合蛋白(Bio-X-Cell,catBP0099)：1mg/mL；HMGB1中和抗体(Shino-Test)：0.2mg/mL。3.鼠尾胶原Ⅰ溶液5mg/mL。4.无菌新鲜的7.5％(w/v)碳酸氢钠溶液或1NNaOH溶液。具有免疫耐受功能的胰岛类器官的制备方法包括以下步骤(按照此方案所制作的具有免疫耐受功能的胰岛类器官共2.5mL体积)：1.用含有胰岛细胞团和间充质干细胞的培养液液各0.5mL充分混合在一起，此时体积为1mL。2.向胰岛细胞团和间充质干细胞的混合溶液中先后加入CTLA4-Ig融合蛋白和HMGB1中和抗体各112.5uL，雷帕霉素25uL，混合均匀，此时溶液总体积为1.25mL。3.取5mg/mL的鼠尾胶原Ⅰ溶液1.25mL，与上述混合液充分混匀，此时总体积为2.5mL，鼠尾胶原Ⅰ浓度为2.5mg/mL。4.鼠尾胶原Ⅰ前体溶液为酸性溶液，在其中加入NaHCO3或者NaOH调节pH值到中性7.4就可使其发生交联缓慢成胶。因此向2.5mg/mL的鼠尾胶原Ⅰ中加入7.5％(w/v)碳酸氢钠溶液15.6uL或者1NNaOH溶液28.8uL就可以使上述浓度为2.5mg/mL的鼠尾胶原Ⅰ2.5mL变为中性，缓慢地发生交联，约1h即可完全成胶。5.在成胶凝固之前注射进体内。上述制备方法胰岛和间充质干细胞被封装在细胞外基质形成的水凝胶中，水凝胶中负载了雷帕霉素、CTLA4-Ig融合蛋白和抗HMGB1中和抗体三种免疫抑制剂，并在移植后能够缓释这三种药物。其中三种免疫抑制剂和间充质干细胞能够在移植物局部诱导免疫耐受，构建免疫耐受微环境的因素，间充质干细胞、细胞外基质蛋白(如鼠尾胶原)能够快速促进血管重建的因素。雷帕霉素为mTOR蛋白抑制剂，2000年建立的胰岛移植Edmondon方案将雷帕霉素应用于移植后的抗免疫排斥反应中。此外，雷帕霉素能够诱导Treg的上调，在NOD小鼠中使用雷帕霉素能够缓解一型糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有免疫耐受功能的胰岛类器官的制备方法，其特征在于：包括将胰岛细胞团、间充质干细胞、免疫抑制剂与支架材料按照体积比1:1:0.5:2.5混合，制成水凝胶材料，交联反应1h即可。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有免疫耐受功能的胰岛类器官的制备方法，其特征在于：包括将胰岛细胞团、间充质干细胞、免疫抑制剂与支架材料按照体积比1:1:0.5:2.5混合，制成水凝胶材料，交联反应1h即可。


2.根据权利要求1所述一种具有免疫耐受功能的胰岛类器官的制备方法，其特征在于：所述免疫抑制剂包括雷帕霉素、CTLA4-Ig融合蛋白和HMGB1中和抗体。


3.根据权利要求2所述一种具有免疫耐受功能的胰岛类器官的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含胰岛细胞团的培养液与含间充质干细胞的培养液按照体积比1:1充分混合；
然后按体积比4.5:4.5:1加入CTLA4-Ig融合蛋白溶液、HMGB1中和抗体溶液和雷帕霉素，得到混合液体；
将鼠尾胶原Ⅰ溶液与所述混合液充分混匀；含胰岛细胞团的培养液与含间充质干细胞的培养液与鼠尾胶原Ⅰ溶液的体积比为1:1:2.5；
最后加入NaHCO3或者NaOH调节pH值到中性，交联反应1h。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：何斯荣，柏雪，王彬，王丹，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50