一种细胞、组织或器官冷保存液的制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及医疗材料的保存领域，尤其涉及一种细胞、组织或器官冷保存液的制备方法与应用。本发明专利技术依据发明专利技术人前期冬眠模式动物研究发现的冷适应机制及专利WO2019/040359 A1进行延伸，通过药物调控FOXO1的入核来提高供体细胞、组织或器官体外冷保存效果。以角膜冷保存为例，在本发明专利技术的新型角膜保存液加用C6 ceramide、Apigenin和Pi的冷保存策略下，角膜内皮细胞存活更佳，死亡率仅为2.5％，且角膜通透性增加。保障了角膜离体冷保存的质量，为成功开展移植手术提供更多可选角膜供体。而冬眠冷适应基于在不同组织和不同物种中均有效，这提示我们可以依据此对不同种属、不同器官进行保存液的改良开发。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞、组织或器官冷保存液的制备方法与应用
本专利技术涉及医疗材料的保存领域，尤其涉及一种细胞、组织或器官冷保存液的制备方法与应用。
技术介绍
器官移植技术自19世纪50年代专利技术以来，经过不断的创新发展，器官移植的术式不断丰富，器官移植的供体范围不断扩大，器官移植受者的生存率不断提高。但现有器官捐献远不能满足巨大的移植供体需求，如何利用好有限的器官资源尤为重要。器官保护液的器官静态冷保存(staticcoldstorage，SCS)技术的迅速发展，使器官保存进一步摆脱了时间和地域的限制，从此器官保护的发展进入了崭新的纪元，极大推动了器官移植事业的进展。一个常见的临床应用例子是为有效保存新鲜角膜开发出的角膜保存液。1947年McCarey发现将角膜置于M-K液中4℃保存4天仍完好如新鲜角膜。之后有学者在M-K液中加入硫酸软骨素等化学物质发展出K-Sol、CSM和Dexsol等保存液。1990年，在将K-液与Dexsol组合并加入链霉素形成现在最广泛使用的中期角膜保存液OptisolGS。根据实验数据显示其可保持角膜活性达12天。之后也有其他改良的保存液诸如陈氏保存液的出现，但保存效果都不能和Optisol相比较。以OptisolGS为代表的现有的器官保存液只能起到中期保存角膜的效果，在12天后角膜大体水肿模糊，内皮细胞出现大面积死亡脱落。这样冷保存后的角膜常常导致角膜移植手术失败。12天的保存期不能满足更大的眼库保存需求，亟需更优的角膜保存策略来满足。目前的器官保存液缺少明确的保护机制指导，这样不利于保存液的改进，也局限了器官保存策略的使用范围。国内外尚未形成系统的冷保存理论体系，亟需探索出更好的冷保存机制来提高目前的冷保存策略。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种细胞、组织或器官冷保存液的制备方法与应用，利用冬眠模式动物冷适应机制对现有器官保存液进行改良。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：提供一种药物在减少细胞、组织或器官在体外冷藏过程中的损伤中的应用，所述药物为可激活FOXO1蛋白进入细胞核的药物。专利技术人发现非冬眠模式动物细胞受冷刺激则会产生线粒体的膜电位超极化应激反应，导致大量的活性氧自由基(reactiveoxygenspecies；ROS)生成，并引起溶酶体的膜通透性增加，令蛋白酶泄漏及细胞内环境酸化，从而破坏细胞的骨架结构及正常功能，造成蛋白变性聚集或降解；这些亚细胞冷应激反应可以用药物调控，减少非冬眠物种的细胞、组织和器官在体外冷藏过程中的损伤。此项发现已申请专利WO2019/040359A1，科研论文发表于Cell(DOI：10.1016/j.cell.2018.03.010)。在本专利技术中，专利技术人从冬眠模式动物细胞实验上发现了FOXO1转录通路是细胞自发冷适应的一个重要通路。在非冬眠动物模型中此通路仅在年轻的个体中保留，在成年个体中则被天然抑制。我们发现通过药物激活FOXO1蛋白进入细胞核，即能使培养细胞、离体小鼠胰岛细胞团和离体大鼠角膜得到更好的冷保存效果。上述发现针对的是FOXO1转录通路在离体细胞、组织甚至复杂器官的冷保存技术中的潜在应用潜力。其它潜在应用领域包括损伤保护、再生和抗衰老等。此项发现与专利WO2019/040359A1相比，针对的是不同的细胞机制，二者没有显而易见的转化联系。作为本专利技术所述应用的优选实施方式，所述药物包括但不限于C6ceramide或Apigenin。作为本专利技术所述应用的优选实施方式，所述组织包括但不限于角膜。作为本专利技术所述应用的优选实施方式，所述应用为将所述药物加入到角膜保存液中用于角膜的保存。本专利技术同时提供一种角膜保存液，所述角膜保存液以1L计算，包括以下组分：氨基酸维他命无机盐其他组分所述角膜保存液的pH＝7.3±2，渗透压＝300±50mOsm。进一步地，以角膜保存为例，专利技术人对现有主流角膜冷保存液OptisolGS的配方进行优化，得到新型角膜保存液，能让大鼠角膜内皮细胞从12天的保存期限延长到28天。冷保存28天后的角膜仍能成功移植到受体大鼠中。作为本专利技术所述角膜保存液的优选实施方式，所述角膜保存液中还包括C6ceramide、Apigenin或蛋白酶抑制剂混合物Pi。所述蛋白酶抑制剂混合物Pi中的组分及各组分在最终角膜保存液中的浓度分别为：胃酶抑素(或天冬氨酸蛋白酶抑制剂，PepstatinA)：1-20μM；亮抑酶肽(或丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂，Leupeptin)：2-40μM。更优选的，所述蛋白酶抑制剂混合物Pi还含有以下组分及各组分在最终角膜保存液中的浓度分别为：苯丁抑制素(或贝他定，Bestatin)：5-50μM；E-64(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)：1.5-30μM；抑肽酶(或抑蛋白酶肽，Aprotinin)：0.08-2μM；AEBSF(4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐)：10-100μM。具体的，所述蛋白酶抑制剂混合物Pi中含有以下组分及各组分在最终角膜保存液中的浓度分别为：胃酶抑素1μM；亮抑酶肽2μM；苯丁抑制素5μM；E-641.5μM；抑肽酶0.08μM；AEBSF100μM。本专利技术还提供一种离体角膜冷藏保存方法，包括以下步骤：(1)取角膜前通过角膜缘造口向前房注射C6ceramide或Apigenin溶液；(2)取角膜保存于角膜保存液中，所述角膜保存液预先添加C6ceramide、Apigenin或Pi。进一步的，专利技术人应用冬眠模式动物冷适应原理在不同组织、不同种属细胞进行探索，得到能应用于不同组织、不同器官的通用冷保存策略。作为本专利技术所述离体角膜冷藏保存方法的优选实施方式，所述角膜保存液为权利要求5中所述角膜保存液。作为本专利技术所述离体角膜冷藏保存方法的优选实施方式，所述Ceramide或Apigenin溶液的溶剂为山羊血清。在临床应用的场景中，溶剂应改用灭菌灭毒的人血清或血清替代品。作为本专利技术所述离体角膜冷藏保存方法的优选实施方式，所述Ceramide溶液中Ceramide的浓度为1-50μM/μL，所述Apigenin溶液中Apigenin的浓度为0.1-10μM/μL。本专利技术的有益效果：本专利技术依据专利技术人前期冬眠模式动物研究发现的冷适应机制及专利WO2019/040359A1进行延伸，通过药物调控FOXO1的入核来提高供体细胞、组织或器官体外冷保存效果。在本专利技术的新型角膜保存液加用C6ceramide(以下简称为C6)、Apigenin和Pi的冷保存策略下，角膜内皮细胞存活更佳，死亡率仅为2.5％，且角膜通透性增加。保障了角膜离体冷保存的质量，为成功开展移植手术提供更多可选角膜供体。而冬眠冷适应基于在不同组织和不同物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种药物在减少细胞、组织或器官在体外冷藏过程中的损伤中的应用，其特征在于，所述药物为可激活FOXO1蛋白进入细胞核的药物。/n

【技术特征摘要】
1.一种药物在减少细胞、组织或器官在体外冷藏过程中的损伤中的应用，其特征在于，所述药物为可激活FOXO1蛋白进入细胞核的药物。


2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物包括C6ceramide或Apigenin。


3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述组织包括角膜。


4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述应用为将所述药物加入到角膜保存液中用于角膜的保存。


5.一种角膜保存液，其特征在于，所述角膜保存液以1L计算，包括以下组分：
氨基酸






维他命



无机盐



其他组分






所述角膜保存液的pH＝7.3±2，渗透压＝300±50mOsm。


6.根据权利要求5所述的角膜保...

【专利技术属性】
技术研发人员：区景行，金光辉，杨扬，刘炜，葛礼浩，
申请(专利权)人：中山大学附属第三医院，
类型：发明
国别省市：广东;44