一种基于宏条形码的家畜采食组成校正模型的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种基于宏条形码的家畜采食组成校正模型的构建方法：其特征在于，其包括：(1)选取源自不同牧草制备模拟日粮，作为校正样品，提取DNA、ITS2条形码PCR扩增、扩增子Illumina MiSeq双末端测序，获得原始测序数据；(2)对原始测序数据进行过滤和质控处理，将有效序列进行OTU聚类；(3)将OTU代表序列与NCBI数据库Blastn比对，完成物种注释；(4)使用宏条形码技术对样本的牧草基因序列进行测定，得到牧草DNA序列的相对比例测定值，分析获得模拟日粮的组分；(5)利用线性回归方法对模拟日粮各组分的测定值、各组分的干物质比例真实值进行关联，建立日粮组成的校正模型。

【技术实现步骤摘要】
一种基于宏条形码的家畜采食组成校正模型的构建方法
本专利技术属于分子生物学领域和畜牧学领域，具体地，本申请提供了一种基于宏条形码的家畜采食组成校正模型的构建方法
技术介绍
放牧家畜的生产性能和营养状况与牧草摄入量密切相关。在放牧条件下，准确掌握家畜的采食成分与采食量极其关键，能够为明晰家畜营养状况和预测家畜生产性能，进而为制定草地管理决策、优化牧草资源配置等提供有效的数据支撑和理论指导。天然草地上的牧草资源丰富，种类繁多，食草家畜摄入的植物种类非常多元化，而且会对特定的牧草种类存在一定的偏好选择，准确测定食草家畜的采食组分仍然面临诸多困难与挑战。国内外常用于估测食草动物采食成分的方法众多，主要有模拟采食法、牧草采食法、食道瘘管法、瘤胃内容物法、粪便显微分析法、植物蜡层指示剂法和近红外光谱法。饱和烷烃技术目前被认为是最准确、最客观的方法，它是将饱和烷烃作为内源指示剂，通过测定家畜所采食各牧草的链烷种类、含量，与粪便中相应链烷的种类、含量建立回归方程，从而估算动物对各牧草的采食比例。该方法能够准确地估测日粮组分简单(4～8种)的动物采食组分。但是当牧草中的烷烃浓度较低或者链烷模式相似时，随着家畜食物组成复杂化，其估测准确性大大降低。此外，蜡层指示剂的特征模式及其回收率也会因季节和地域等因素有所差异，直接影响季节性采食估测结果的准确性。DNA条形码技术(DNAbarcoding)，是指用基因组内一段标准的、相对较短的DNA片段来鉴定物种或者其变异类型的一项分子鉴定新技术。该技术摆脱了传统鉴定方法依赖长期经验的障碍，通过建立标准数据库，可实现对物种的快速准确鉴定，是分子鉴定方法学上的创新。然而DNA条形码技术依赖传统的Sanger测序技术，尚无法实现地对多个体多物种的混合样品进行高效快速分类及评估，而且从陈旧材料难以获得完整、高质量的DNA模板。基于高通量测序技术(也称二代测序技术)的DNA宏条形码技术有望克服这一难题。DNA宏条形码技术，也叫DNA复合条形码技术，是指利用高通量技术同时获得很多物种的条形码基因扩增子序列，借助生物信息学分析手段对群落的分类单元组成进行鉴定。它的工作原理是：(1)从环境样本中提取DNA；(2)选取合适的DNA条形码作为分子标记；(3)利用条形码通用引物从环境样本中获得扩增子；(4)利用合适的高通量测序平台，对大量的扩增子进行高通量测序；(5)将测序得到的序列与参考数据库进行比对，得到物种注释信息；(6)对测序结果进行生物信息学分析。近些年来，DNA宏条形码技术(DNAmetabarcoding)在量化膳食成分上的研究取得很大进展。研究表明，DNA宏条形码技术因其快速、操作简单、健壮等优势，适合测定食草类动物的食物组分。但是基于植物DNA条形码分析食草动物的饮食面临的困难更大。在动物食物组分的鉴定研究中，人们关注的是宏条形码技术是否能够针对动物所消耗的成分做出足够精确的估计。我们前期通过绵羊舍饲试验评估了DNA宏条形码技术在估测放牧家畜采食组分上的准确性。发现，通过从粪便中扩增植物ITS2条形码并进行IlluminaMiSeq测序，能够定性鉴定绵羊所采食的牧草种类。并且初步证实绵羊粪便中回收得到的牧草DNA序列比例与绵羊实际消耗的牧草比例存在线性关系。而由于食草动物消耗的种类及其消化率也存在差异等复杂因素，测定结果存在偏差在所难免。先前已经针对绵羊消耗的部分牧草比例构建的定量预测模型其准确性仍需要进一步补充和完善。
技术实现思路
一方面，本专利技术提供了一种基于宏条形码的家畜采食组成校正模型的构建方法：包括：(1)选取源自不同牧草制备模拟日粮，以此作为校正样品，提取混合样本DNA、ITS2条形码PCR扩增、扩增子IlluminaMiSeq双末端测序，获得校正样品的原始测序数据；(2)对原始测序数据进行过滤和质控处理，将有效序列进行操作分类单元OTU聚类；(3)将OTU代表序列与NCBI数据库Blastn比对，在属或种水平上完成物种注释；(4)使用宏条形码技术对每个混合样本的牧草基因序列进行测定，得到牧草DNA序列的相对比例测定值，分析获得模拟日粮的组分；(5)利用线性回归方法对模拟日粮各组分的测定值、各组分的干物质比例真实值进行关联，建立日粮组成的校正模型。进一步地，提取混合样本DNA包括液氮研磨步骤。进一步地，ITS2条形码PCR扩增时所用引物为rD5-ITS2：TCCTCCGCTTATTGATATGC以及rb1-ITS2f：CGATACTTGGTGTGAATTGCAG。进一步地，步骤(2)中的质控处理包括(i)过滤read尾部质量值20以下的碱基，以50bp为一个滑动窗口，若窗口内序列的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基。过滤质控后读长小于50bp的reads；(ii)根据PEreads之间的重叠关系，将成对reads拼接成一条序列，相互拼接上的序列之间，重叠区最小重叠长度为10bp，拼接序列的重叠区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；(iii)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2，去掉无法拼接的序列，最后去除barcode标签及引物序列。进一步地，步骤(2)中的OTU聚类使用Usearchversion软件，按照97％相似性进行，在聚类过程中使用UCHIME软件识别并去除嵌合体序列。进一步地，还包括回归校正步骤。进一步地，回归校正中使用Kulczyński相似系数(KSI，％)来评价准确性，其计算公式如下：其中，ci是模拟日粮中第i个牧草的真实值与估测值之间的较小值；(ai+bi)是每一种牧草组分的真实值与估测值的比例之和。另一方面，本申请提供了上述方法在家畜采食组成测定中的应用。进一步地，所述家畜为绵羊。本申请中的牧草可根据具体需要和条件选择各种已知或未知的种类，包括但不限于碱茅属(Puccinellia)、狗牙根属(Cynodon)、早熟禾属(Poa)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、赖草属(Leymussp.)、苜蓿属(Medicago)、车轴草属(Trifolium)、菊苣属(Cichorium)9个属等属的，碱茅(Puccinelliadistans)、狗牙根(Cynodondactylon)、草地早熟禾(Poapratensis)、黑麦草(Loliumperenne)、直立雀麦(Bromuserectus)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、红三叶(Trifoliumpratense)、菊苣(Cichoriumintybus)、狐尾三叶草(Trifoliumrubens)、鳞状三叶草(Trifoliumsquamosum)大麦状雀麦(Bromushordeaceus)等具体种。本申请中的家畜包括各种食草或杂食类家畜，包括但不限于羊如山羊、绵羊或肉用羊、毛用羊、肉毛兼用羊；牛如奶牛、肉牛；猪；马；驴等。本申请本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于宏条形码的家畜采食组成校正模型的构建方法：其特征在于，其包括：/n(1)选取源自不同牧草制备模拟日粮，以此作为校正样品，提取混合样本DNA、ITS2条形码PCR扩增、扩增子Illumina MiSeq双末端测序，获得校正样品的原始测序数据；/n(2)对原始测序数据进行过滤和质控处理，将有效序列进行操作分类单元OTU聚类；/n(3)将OTU代表序列与NCBI数据库Blastn比对，在属或种水平上完成物种注释；/n(4)使用宏条形码技术对每个混合样本的牧草基因序列进行测定，得到牧草DNA序列的相对比例测定值，分析获得模拟日粮的组分；/n(5)利用线性回归方法对模拟日粮各组分的测定值、各组分的干物质比例真实值进行关联，建立日粮组成的校正模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于宏条形码的家畜采食组成校正模型的构建方法：其特征在于，其包括：
(1)选取源自不同牧草制备模拟日粮，以此作为校正样品，提取混合样本DNA、ITS2条形码PCR扩增、扩增子IlluminaMiSeq双末端测序，获得校正样品的原始测序数据；
(2)对原始测序数据进行过滤和质控处理，将有效序列进行操作分类单元OTU聚类；
(3)将OTU代表序列与NCBI数据库Blastn比对，在属或种水平上完成物种注释；
(4)使用宏条形码技术对每个混合样本的牧草基因序列进行测定，得到牧草DNA序列的相对比例测定值，分析获得模拟日粮的组分；
(5)利用线性回归方法对模拟日粮各组分的测定值、各组分的干物质比例真实值进行关联，建立日粮组成的校正模型。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其中提取混合样本DNA包括液氮研磨步骤。


3.根据权利要求1所述的构建方法，其中步骤(1)中ITS2条形码PCR扩增时所用引物为rD5-ITS2：TCCTCCGCTTATTGATATGC以及rb1-ITS2f：CGATACTTGGTGTGAATTGCAG。


4.根据权利要求1所述的构建方法，其中步骤(2)中的质控处理包括(i)过滤read尾部质量值20以下的碱基，以50bp为一个滑动窗口，若窗口内序列的平均质量值低...

【专利技术属性】
技术研发人员：张英俊，郭艳萍，罗海玲，张浩，陈文青，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11