利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的培养基和培养方法技术

本发明专利技术涉及一种利用兽疫链球菌发酵生产高分子量透明质酸的培养基和培养方法，本发明专利技术培养基组成中剔除了葡萄糖、蛋白胨等物质，并引入了脱脂蚕蛹粉、鱼熔浆蛋白粉和酵母蛋白粉等物质，从而有效提高透明质酸发酵单位和分子量，降低发酵成本，并使得后续的提取纯化工艺更为简单。

【技术实现步骤摘要】
利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的培养基和培养方法
本专利技术属于生物发酵
，特别是涉及一种利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的培养基和培养方法。
技术介绍
透明质酸（Hyaluronicacid）是一种由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸为结构单元的高分子粘多糖，商品透明质酸一般为其钠盐，即透明质酸钠（SodiumHyaluronate），简称HA。习惯上仍称为透明质酸。透明质酸具有特殊的保水作用，份量更高达其本身重量的100倍，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。与其他营养成分配合使用，可以起到促进营养吸收的更理想效果。目前，国内透明质酸的发酵生产通常采用以兽疫链球菌为生产菌种的三级发酵模式，该方式存在的问题是：1.国产医用透明质酸分子量低，大部分医用透明质酸仍需要进口。根据透明质酸理化性质，其分子量越高，吸收效果越好，特别是在医用方面，透明质酸分子量达到4000kDa以上，其治疗效果更好。但是，目前国产医用透明质酸分子量仅在2000-3000kDa，而且仅仅是少数企业生产的透明质酸分子量达到了2000kDa以上。2.国内透明质酸的发酵技术水平相对较低，通常在11g/L以下。3.国内透明质酸发酵生产成本较高，主要原因是培养基中加入了牛肉浸膏或蛋白胨及其它动物性蛋白，且用量较大，导致培养基成本较高。同国外生产企业比较，国际市场竞争力较弱。4.国内透明质酸发酵技术中，通常以葡萄糖作为培养基的速效碳源，由于葡萄糖在灭菌过程中易产生“美拉德反应”，即产生抑制菌体的有毒物质，从而影响发酵效价。5.国内透明质酸发酵技术中，有些在培养基组成中加入了动物蛋白胨，发酵培养结束，发酵液中残留了部分动物蛋白，增加了发酵液的粘度，对其提取和纯化有一定的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种可提高透明质酸分子量，有效提高发酵单位，同时降低生产成本，降低提取纯化难度的利用兽疫链霉菌发酵生产透明质酸的培养基。本专利技术的另一目的是提供利用上述培养基生产透明质酸的培养方法。为实现上述目的所采取的技术方案为：一种利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的培养基，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中所述一级种子培养基组成为：果葡糖浆25～30g/L，脱脂蚕蛹粉35～40g/L，鱼熔浆蛋白粉25～30g/L，玉米浆干粉45～50g/L，硫酸铵0.5～0.9g/L，轻质碳酸钙1～5g/L；所述二级种子培养基的组成为：果葡糖浆35～40g/L，脱脂蚕蛹粉35～40g/L，鱼熔浆蛋白粉25～30g/L，玉米浆干粉45～50g/L，硫酸铵0.5～0.9g/L，轻质碳酸钙1～5g/L；所述发酵培养基的组成为：果葡糖浆55～60g/L，脱脂蚕蛹粉35～40g/L，鱼熔浆蛋白粉25～30g/L，玉米浆干粉45～50g/L，啤酒酵母蛋白粉26～30g/L，硫酸铵0.5～0.9g/L，轻质碳酸钙1～5g/L，磷酸二氢钾0.1～0.5g/L，氯化钠0.002～0.006g/L，硫酸镁0.03～0.07g/L，硫酸亚铁0.1～0.5g/L，氯化锰0.003～0.007g/L，司盘800.1～0.5g/L，聚醚改性硅油0.2～0.4ml/L。一种利用上述培养基发酵生产透明质酸的培养方法，其特征在于其工艺步骤为：1）一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的透明质酸钠摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行种子培养，OD≥2.0移种；2）二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，OD≥2.0移种；3）发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至透明质酸含量＞12g/L、透明质酸分子量＞4500KDa时终止发酵。所述培养好的透明质酸摇瓶发酵液质量要求为菌体浓度20-30%；镜检无杂菌。所述一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温35～36℃；空气流量20～40m3/h，搅拌转速60～80r/min；所述二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温35～36℃；空气流量40～60m3/h；搅拌转速60～80r/min；所述发酵培养条件为：a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在7.0-7.2；b温度：35～36℃；c搅拌转速：转速控制在80-100r/min；d压力控制：罐压0.05～0.06MPa；epH控制：发酵过程中pH控制在6.9-7.2；f空气流量：150～200m3/h；h溶氧控制：发酵前9h，不控制溶氧；10h～发酵结束：溶氧控制在40%以上。所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补尿苷二磷酸葡萄糖、补水和补果葡糖浆，其中a补尿苷二磷酸葡萄糖工艺控制：发酵21h时，补入腺苷二磷酸葡萄糖，控制其在发酵液中的浓度为0.1-0.3g/L；b补水工艺控制：发酵9～21h时，当OD≥2.5，加入灭菌水，发酵过程中控制OD在2～2.5，每隔3h检测发酵液OD；发酵21h～发酵结束，加入灭菌水，控制发酵液体积为发酵罐的75-80%；c补入果葡糖浆：发酵9-21h时，当发酵液总糖含量＜5mg/100ml时，补入已灭菌的果葡糖浆溶液，使总糖的含量控制在10～15mg/100ml。本专利技术的技术优势体现在：1本专利技术确认了利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。众所周知，由于碳源和氮源在生物生长过程中有着十分重要的影响，在分析营养源对兽疫链霉菌生长的影响时，企业技术人员在碳氮比以及碳源和氮源浓度对发酵过程的影响方面作了大量的研究。发现，碳氮比过高和过低都不利于细胞生长和外源蛋白表达和积累，过低导致菌体提早自溶；过高导致细菌代谢不平衡，最终不利于产物的积累。即使碳氮比处在合适水平，碳源和氮源浓度过高和过低也不利于细胞生长和外源蛋白表达和积累，浓度过高，细胞在发酵过程后期生长缓慢，代谢废物产生较多，最终使得菌体代谢异常，影响外源蛋白合成；浓度过低，培养基所能提供的营养物质有限，影响细胞的繁殖。本专利技术通过开展一些列研究，最终确认了利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例，以此为基础，其大生产的发酵技术水平是HA含量＞12g/L、HA分子量＞4500KDa，处于国内领先水平。2本专利技术培养基中引入了脱脂蚕蛹粉、鱼熔浆蛋白粉和酵母本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的培养基，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中/n所述一级种子培养基组成为：果葡糖浆25～30g/L，脱脂蚕蛹粉35～40g/L，鱼熔浆蛋白粉25～30g/L，玉米浆干粉45～50g/L，硫酸铵0.5～0.9g/L，轻质碳酸钙1～5g/L；/n所述二级种子培养基的组成为：果葡糖浆35～40g/L，脱脂蚕蛹粉35～40g/L，鱼熔浆蛋白粉25～30g/L，玉米浆干粉45～50g/L，硫酸铵0.5～0.9g/L，轻质碳酸钙1～5g/L；/n所述发酵培养基的组成为：果葡糖浆55～60g/L，脱脂蚕蛹粉35～40g/L，鱼熔浆蛋白粉25～30g/L，玉米浆干粉45～50g/L，啤酒酵母蛋白粉26～30g/L，硫酸铵0.5～0.9g/L，轻质碳酸钙1～5g/L，磷酸二氢钾0.1～0.5g/L，氯化钠0.002～0.006g/L，硫酸镁0.03～0.07g/L，硫酸亚铁0.1～0.5g/L，氯化锰0.003～0.007g/L，司盘80 0.1～0.5g/L，聚醚改性硅油0.2～0.4ml/L。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的培养基，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中
所述一级种子培养基组成为：果葡糖浆25～30g/L，脱脂蚕蛹粉35～40g/L，鱼熔浆蛋白粉25～30g/L，玉米浆干粉45～50g/L，硫酸铵0.5～0.9g/L，轻质碳酸钙1～5g/L；
所述二级种子培养基的组成为：果葡糖浆35～40g/L，脱脂蚕蛹粉35～40g/L，鱼熔浆蛋白粉25～30g/L，玉米浆干粉45～50g/L，硫酸铵0.5～0.9g/L，轻质碳酸钙1～5g/L；
所述发酵培养基的组成为：果葡糖浆55～60g/L，脱脂蚕蛹粉35～40g/L，鱼熔浆蛋白粉25～30g/L，玉米浆干粉45～50g/L，啤酒酵母蛋白粉26～30g/L，硫酸铵0.5～0.9g/L，轻质碳酸钙1～5g/L，磷酸二氢钾0.1～0.5g/L，氯化钠0.002～0.006g/L，硫酸镁0.03～0.07g/L，硫酸亚铁0.1～0.5g/L，氯化锰0.003～0.007g/L，司盘800.1～0.5g/L，聚醚改性硅油0.2～0.4ml/L。


2.按照权利要求1所述培养基发酵生产透明质酸的培养方法，其特征在于其工艺步骤为：
1）一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的透明质酸钠摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行种子培养，OD≥2.0移种；
2）二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，OD≥2.0移种；
3）发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至透明质酸含量＞12g/L、透明质酸分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：任勇，徐淑芬，
申请(专利权)人：宁夏泰胜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏;64