制备酰化多肽步骤中色谱固定相的再生方法技术

本发明专利技术提供一种适用于工业化应用的色谱固定相再生方法，通过色谱固定相与含有至少一种弱碱、一种有机溶剂和少于70％(v/v)水的再生溶液接触来恢复色谱固定相的性能，实现了在色谱纯化循环内完成色谱固定相的再生，使色谱柱再生后就可以进行下一个纯化循环，使多个纯化循环可以连续进行，不破坏色谱固定相，操作简单、安全且经济有效。

【技术实现步骤摘要】
制备酰化多肽步骤中色谱固定相的再生方法
本专利技术涉及色谱纯化领域，更具体的说，涉及一种用于酰化多肽纯化的色谱固定相的再生方法。
技术介绍
多肽药物已被应用于多种疾病如糖尿病和肿瘤等的治疗，批准的多肽药物包括胰岛素及其突变体、利拉鲁肽、索玛鲁肽、艾塞那肽、戈舍瑞林、亮丙瑞林等，这些药物的全球市场销售额超过100亿美元，在改善患者的生活质量和提高患者健康方面发挥着重要作用。由于天然的多肽药物一般半衰期较短，因此一般需要通过化学修饰等技术手段改善其药理特定，例如典型的变体为酰胺、糖类、烷基、酰基、酯、聚乙二醇化等修饰，相关的技术报道可参考WO96/29342、WO98/08871、WO99/43708、WO00/34331、WO00/69911、CN97198413.1和CN200680006674.6等。多肽药物在制备过程中，由于其分子量较普通蛋白质要小一些，因此纯化的整个过程中经常用到多步纯化法。其中，反相高压色谱法(RP-HPLC)是工业上分离多肽的优选方法，而且该方法已被证明对于大规模纯化多种多肽是通用的。同时，只有高纯度的多肽样品才能满足治疗的需要，以避免在对患者施用时引起不良事件。生产过程中需要应用反相色谱纯化来达到制备高纯度多肽的目的，随着循环次数的增加，色谱柱分离效能会逐渐降低，这是由于一些沉积物在色谱柱中逐渐积累所引起的，导致多次循环后色谱柱纯化效果逐渐降低，产物纯度和收率逐渐下降。然而，色谱固定相非常昂贵，频繁更换色谱固定相无疑会大量增加生产成本，所以需要对色谱固定相进行再生，以提高反复利用度。而大规模生产高纯度多肽的经济性，对于多肽产品的商业化和现有疗法的推广具有关键性的作用。WO00/61493中公开了再生多种来源的粒状物质(黏土、砂、二氧化硅等)的方法。它是一种5步法，包括：将所述物质与a)有机物质提取，b)氧化剂接触，随后与c)酸溶液接触，d)将物料加热以及e)回收所述物质。可见，该酸性溶液再生色谱固定相的方法非常复杂，而且再生溶液需要在色谱柱外与固定相接触，由于操作繁琐，不适合大规模的工业化应用。CN200480009293.4中公开了采用较纯的甲酸(含水量低于1％的甲酸溶液)作为再生溶液再生色谱固定相。但是，纯甲酸属于易挥发性强酸，具有极强的腐蚀性，因此，纯甲酸存在生产设备腐蚀风险和安全风险。当然，也有研究用苛性碱溶液再生色谱固定相，例如0.1摩尔氢氧化钠(videLiliedahl，“致力于肽的基于二氧化硅的HPLC纯化的十二年”，Tides2000，2000年5月10日，LasVegas，USA)。该再生方法可将用于纯化胰岛素的二氧化硅的使用寿命增大至100～600次循环。但是，二氧化硅物质暴露于苛性碱条件下时不稳定，特别是取代的二氧化硅物质可能不适合通过苛性碱溶液再生。由于现有色谱固定相再生方法的不足，以及色谱固定相的昂贵价格，为了降低大规模工业化生产高纯度多肽的生产成本和操作难度，开发一种操作简单，安全，不破坏色谱柱固定相，且适用于工业化应用的色谱固定相再生方法是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种适用于工业化应用的色谱固定相再生方法，通过色谱固定相与再生溶液接触来恢复色谱固定相的性能，操作简单、安全且经济有效。本专利技术提供了一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与含有至少一种弱碱、一种有机溶剂和少于70％(v/v)的水的再生溶液接触。所述弱碱是再生方法中至关重要的条件，在没有弱碱的情况下，无法达到再生的目的。弱碱指在水溶液中不完全电离的碱，意即质子化反应不完全。一般碱的pH值范围为7-14，其中7为中性，14则为强碱性，相对强碱而言，弱碱从水分子接受质子的能力较差，因而溶液中H+浓度更高，pH值较低。本专利技术的一个实施方案中，所述弱碱包括氨水，碳酸盐，DIEA(N,N-二异丙基乙胺)、二乙胺、三乙胺等铵类化合物，优选为氨水。其中，所述的碳酸盐包括碳酸钠，碳酸氢钠，碳酸钾，碳酸氢钾，碳酸铵，碳酸氢铵等弱碱。本专利技术的一个实施方案中，所述弱碱浓度为0.1-2％(v/v)，优选为0.2-1.5％(v/v)，更优选为0.5-1.5％(v/v)，更优选为0.8-1.2％(v/v)，更优选为1％(v/v)。本专利技术另一实施方案中，所述的弱碱为浓度为0.1-2％(v/v)的氨水，优选为0.2-1.5％(v/v)的氨水，更优选为0.5-1.5％(v/v)的氨水，更优选为0.8-1.2％(v/v)的氨水，更优选为1％(v/v)的氨水。一定比例的有机溶剂是再生方法中的重要参数，洗脱后残留在色谱柱中的残留物多为疏水性较强的物质，再生溶液中含有一定比例的有机溶剂可以增强残留物的溶解度，并减少残留物在色谱柱中保留。本专利技术的一个实施方案中，所述有机溶剂包括乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇等，优选乙腈。另一个实施方案中，所述有机溶剂浓度为30％-70％(v/v)，优选为35％-65％(v/v)，更优选为40％-60％(v/v)，更优选为45％-55％(v/v)，最优选为50％(v/v)。本专利技术另一实施方案中，所述有机溶剂为浓度为30％-70％(v/v)的乙腈，优选为35％-65％(v/v)的乙腈，更优选为40％-60％(v/v)的乙腈，更优选为45％-55％(v/v)的乙腈，最优选为50％(v/v)的乙腈。在另一个实施方案中，所述再生液中的水含量少于70％(v/v)，更优选少于65％(v/v)、60％(v/v)、55％(v/v)或者50％(v/v)。在另一个优选实施方案中，所述弱碱为氨水，而且所述有机溶剂为乙腈。在另一个实施方案中，所述弱碱为0.1-2％(v/v)的氨水，而且所述有机溶剂为30％-70％(v/v)的乙腈。在另一个实施方案中，所述弱碱为0.2-1.5％(v/v)的氨水，而且所述有机溶剂为35％-65％(v/v)的乙腈。在另一个实施方案中，所述弱碱为0.5-1.5％(v/v)的氨水，而且所述有机溶剂为40％-60％(v/v)的乙腈。在另一个实施方案中，所述弱碱为0.8-1.2％(v/v)的氨水，而且所述有机溶剂为45％-55％(v/v)的乙腈。在另一个实施方案中，所述弱碱为1％(v/v)的氨水，而且所述有机溶剂为50％(v/v)的乙腈。在另一个实施方案中，所述再生液的pH范围为9-12，优选为9.5-11.5，更优选为10-11或10.5-11.5，最优选pH为11。在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与再生溶液接触，其中所述的再生溶液含有0.1-2％(v/v)的氨水，30％-70％(v/v)的乙腈和少于70％(v/v)的水，溶液的pH为范围为9-12。在另一个优选的实施方案中，本专利技术提供了一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与再生溶液接触，其中所述的再生溶液含有0.2-1.5％(v/v)的氨水，35％-65％(v/v)的乙腈和少于65％(v/v)的水，溶液的pH为范围本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与含有至少一种弱碱、一种有机溶剂和少于70％(v/v)的水的再生溶液接触。/n

【技术特征摘要】
20191231 CN 20191141215171.一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与含有至少一种弱碱、一种有机溶剂和少于70％(v/v)的水的再生溶液接触。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述弱碱包括氨水、碳酸盐、DIEA、二乙胺、三乙胺等铵类化合物，其中所述的碳酸盐包括碳酸钠，碳酸氢钠，碳酸钾，碳酸氢钾，碳酸铵，碳酸氢铵等弱碱。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂包括乙腈、乙醇、甲醇或异丙醇。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述再生溶液的pH范围为9-12、9.5-11.5、10-11、10.5-11.5或pH为11。


5.一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与再生溶液接触，其中所述的再生溶液含有0.1％-2％(v/v)的氨水，30％-70％(v/v)的乙腈和少于70％(v/v)的水，溶液的pH范围为9-12。


6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述色谱固定相是RP-HPLC基体。


7.一种生产治疗用多肽或其前体的方法，包括至少一个色谱处理步骤，其中通过一种再生色谱固定相的方法将色谱固定相再生，其中，在5℃～60℃范围内的温度下，将所述色谱固定相与含有至少一种弱碱、一种有机溶剂和少于70％(v/v)的水的再生溶液接触；其中，所述治疗用多肽选自酰化的GLP-1、酰化的GLP-1类似物或酰化的GLP-1/GIP双靶点激动剂。


8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，用于被酰化的GLP-1多肽或其类似物选自GLP-1(7-37)，GLP-1(8-37)，GLP-1(9-37)，GLP-1(10-37)，GLP-1(11-37)，GLP-1(12-37)，GLP-1(13-37)，GLP-1(14-37)，GLP-1(15-37)或GLP-1多肽类似物，包括：Arg34-GLP-1(7-37)，Arg26-GLP-1(7-37)，Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39)，Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40)，Arg26Lys36-GLP-1(7-37)，Arg34Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26Lys39-GLP-1(7-39)，Arg34Lys40-GLP-1(7-40)，Arg26,34Lys36,39-GLP-1(7-39)，Arg26,34Lys36,40-GLP-1(7-40)，Gly8Arg26-GLP-1(7-37)，Gly8Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39)，Gly8Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40)，Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26Lys39-GLP-1(7-39)，Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40)，Gly8Arg26,34Lys36,39-GLP-1(7-39)，Gly8Arg26,34Lys36,40-GLP-1(7-40)，Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39)，Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40)，Arg26,34Lys41-GLP-1(7-41)，Arg26,34Lys42-GLP-1(7-42)，Arg26,34Lys43-GLP-1(7-43)，Arg26,34Lys44-GLP-1(7-44)，Arg26,34Lys45-GLP-1(7-45)，Arg26,34Lys38-GLP-1(1-38)，Arg26,34Lys39-GLP-1(1-39)，Arg26,34Ly...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐文长，马国昌，徐飞虎，李博，关今韬，
申请(专利权)人：杭州九源基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33