使用干细胞治疗宫腔粘连的方法技术

本发明专利技术涉及使用干细胞治疗宫腔粘连的方法。该方法中涉及到一种细胞制剂，其中包含羊膜间充质干细胞和药用溶媒。所述药用溶媒是水；该细胞制剂是供注射方式使用的制剂。所述羊膜间充质干细胞是经传代培养至1～20代的细胞，所述羊膜间充质干细胞的浓度为(1～8)×10

【技术实现步骤摘要】
使用干细胞治疗宫腔粘连的方法
本专利技术属于干细胞治疗
，涉及从人羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法，还涉及由该方法制备获得的羊膜间充质干细胞，以及它们的治疗用途。具体涉及的治疗用途是使用干细胞治疗宫腔粘连，促进子宫内膜修复的细胞制剂。尤其是涉及使用羊膜间充质干细胞配制成的制剂，将其用于治疗宫腔粘连的用途。
技术介绍
宫腔粘连(intrauterineadhesions，IUA)又称Asherman综合征，是严重危害女性身心健康的临床常见疾病之一。任何形式的宫腔内手术操作，感染等均可引起的子宫内膜损伤，进而导致子宫内膜粘连和纤维化，宫腔部分或全部闭塞，表现为月经稀发、闭经、反复流产、不孕症等一系列临床症候。文献报道。我国不孕症的发病率6～15％，其中包括着床障碍等宫腔环境因素占全部病因学的15～31％，且有上升趋势。如何预防，逆转，修复子宫内膜损伤，是治疗宫腔粘连的关键因素。现有的治疗手段局限，治疗效果差复发率高。临床治疗措施主要是基于粘连松解术后刺激子宫内膜再生，以及防治术后再粘连。包括雌激素疗法、宫腔内球囊、可吸收防粘连物质置放、羊膜宫腔移植等等。雌激素可刺激子宫内膜再生，加速祼露区的上皮化，覆盖子宫创面，防止新的粘连形成。因此，粘连松解术后联合使用雌激素成为主要的治疗手段，是公认的最佳治疗方案。但治疗后有效率不足30％，且复发率超过23.5％，其中20.0％～62.5％为重度粘连。因此，研究开发安全、有效的新的临床治疗方案一直是该领域的热点和难点问题。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一类具有自我复制和多向分化潜能的成体干细胞，在再生医学领域发挥着非常广泛的作用。MSCs具有多向分化潜能、抑制炎症、归巢能力、免疫原性低、来源广泛、易于分离、培养扩增和无伦理学限制等优势，成为再生医学理想的细胞来源。近年来，国内外初步研究结果显示，MSCs能修复受损子宫内膜，改善其功能，并恢复部分生育能力，为宫腔粘连的治疗提供了新的治疗策略，为IUA患者带来新的希望。干细胞是再生医学发展的基础，其有效的应用是实现人类健康长寿、防癌抗衰、永保年轻状态、持续提高生活质量等终极梦想的有效方法。近年来，胚胎干细胞与成体干细胞在细胞生物学以及再生医学研究领域倍受重视。然而，尽管胚胎干细胞具有其他细胞无法企及的全能性，但致瘤性、同种异体移植后的免疫排斥性以及无法避免的伦理争议等因素在很大程度上限制了其在临床的应用，而成体干细胞在组织中含量较少，缺乏特异性的表面标志的特点也成为其临床应用的桎梏。由于干细胞的多项分化潜能及其分泌多种细胞因子的功能，备受研究者的青睐。近年来，干细胞在组织损伤与修复中的应用越来越广泛，而干细胞的来源一直是人们关注的焦点。骨髓间充质干细胞是较早被认识的成体干细胞之一。但由于抽取骨髓给患者带来痛苦，而且骨髓干细胞的含量极少，使大量获得受到限制。其他来源如脂肪组织，皮肤组织等都需取材于人体自体或异体组织，也不易取材或可能涉及伦理问题。人羊膜来源于人胎盘组织，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性，厚0.02-0.5mm，在电镜下，其分为5层：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。羊膜属于孕妇生产后的废弃物，一个胎盘的羊膜面积大约有600cm2，而且羊膜易于从胎盘上剥离，所以因羊膜具有取材方便，原料充足的特点而被认为是目前间充质干细胞的最佳来源之一。人羊膜为半透明的薄膜，有多种促进细胞增殖的营养成分。羊膜基底膜和羊膜基质层含有大量不同的胶元，主要为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原和纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等成分。新鲜羊膜能产生一些生长因子，如：碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和转化生长因子β等。目前，正在研究利用羊膜干细胞治疗多种疾病，包括神经系统疾病、心肌梗死、肌萎缩症、糖尿病及肝纤维化等。有研究表明羊膜间充质干细胞通过有高的血管生成能力和移植成活力，能促进糖尿病大鼠伤口的愈合。人羊膜来源的干细胞包括人羊膜上皮细胞(humanamnioticepithelialcells，hAEC)和人羊膜间充质干细胞(humanamnioticmes-enchymalstromalcells，hAMSC)，它们均能够表达多种胚胎干细胞标记物，并且均具有较全面的多向分化潜能。已有研究发现，培养的人羊膜间充质干细胞除表达神经干细胞的特异性标志蛋白nestin外，还表达干细胞特异性转录因子八聚体连接蛋白4(octamer-bindingprotein4，Oct-4)，且表达能力比骨髓间充质干细胞更强。近来报道证实了其有向三胚层细胞分化的潜能：外胚层(神经)、中胚层(骨骼肌、心肌、内皮等)、内胚层(胰腺、肝)。有研究表明，培养3～4周后得到大量的贴壁间充质干细胞，形态学类似于骨髓间充质干细胞，且其比骨髓来源的MSCs具有更强的增殖能力。试验中流式细胞仪检测的结果符合以上结论，说明羊膜细胞具有与间充质干细胞相似的表面标志。在体外至少可以传到第15代而保持其形态不变。现有技术已公开了诸多制备人羊膜间充质干细胞的方法，例如CN106754674B(中国专利号ZL2016111295528)，其全部内容通过引用并入本文。利用围产组织来源的间充质干细胞，尤其是羊膜来源的间充质干细胞，制备一种干细胞制剂，在粘连松解术后，通过子宫内膜进行肌肉注射间充质干细胞制剂，促进子宫内膜再生修复，治疗宫腔粘连，仍然是本领域技术人员迫切期待的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种围产组织来源的间充质干细胞，尤其是羊膜来源的间充质干细胞，制备成的干细胞制剂，在粘连松解术后，通过子宫内膜进行肌肉注射间充质干细胞制剂，促进子宫内膜再生修复，治疗宫腔粘连。已经出人意料地发现，使用本专利技术的干细胞制剂治疗宫腔粘连呈现令人满意的效果。本专利技术基于此类发现而得以完成。为此，本专利技术第一方面提供了一种细胞制剂，其中包含羊膜间充质干细胞和药用溶媒。根据本专利技术第一方面所述的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；(3)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30～60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中，添加20ml完全培养基，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于治疗宫腔粘连的细胞制剂，其中包含羊膜间充质干细胞和药用溶媒。/n

【技术特征摘要】
1.用于治疗宫腔粘连的细胞制剂，其中包含羊膜间充质干细胞和药用溶媒。


2.根据权利要求1的细胞制剂，其中所述药用溶媒是水；和/或，其是供注射方式使用的制剂。


3.根据权利要求1的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞是经传代培养至1～20代的细胞，例如是经传代培养至1～15代的细胞，例如是经传代培养至1～12代的细胞。


4.根据权利要求1的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞的浓度为(1～8)×106个/ml，例如为(1.5～6)×106个/ml，例如为(2～4)×106个/ml；或者其中还包含氯化钠，例如其浓度为7～10mg/ml，例如为7.5～9.5mg/ml，例如为8～9mg/ml；或者其中还包含泛酸钙，例如其浓度为0.5～5mg/ml，例如为1～4mg/ml，例如为1.5～3.5mg/ml；或者其中其中还包含鸟氨酸，例如其浓度为5～35mg/ml，例如为10～30mg/ml，例如为15～25mg/ml；或者其具有如本发明实施例任一项所述配方。


5.根据权利要求1的细胞制剂，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：将氯化钠等药用辅料用适量水溶解，得到盐水溶液；将传代培养所得间充质干细胞转移至离心管中离心(例如2000rpm离心5min)，弃上清，加盐水溶液使细胞重悬，制得细胞制剂。


6.根据权利要求1的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；
(3)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30～60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；
(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：
滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10～15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
组织块部分：将收集的组织块置于75cm2培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO2、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10～15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
(5)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述从P0代到P1代的传代操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代直至P15代的细胞传代，得到P1代至P15代的羊膜间充质干细胞。


7.根据权利要求6的细胞制剂，其中：
所述基础平衡盐溶液中包括链霉素和青霉素两种抗生素；
所述基础平衡盐...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘冰，李容，汤乐，王正，肖海蓉，陆伟峰，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32