改善植物中基因组工程化和再生的方法II技术

本文件涉及用于真核细胞中的基因组工程化的方法和材料，以及尤其涉及通过共同递送一个或多个加强子多肽和加强基因的组合与基因组工程化组分来提高基因组工程化(即转化或基因组编辑)效率的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改善植物中基因组工程化和再生的方法II
本文描述了再生加强子(booster)基因和多肽的新组合，以及用于真核细胞中基因组工程化的方法和材料，以及尤其是通过共同递送加强子多肽和加强基因与基因组工程化组件来提高基因组工程化(即，转化或基因组编辑)效率的方法。专利技术背景传统育种已提供了驯养的植物和动物，而现代生物技术(尤其是基因组工程化)正在扩大育种能力，并实现仅用传统近缘种(closespecies)的杂交无法实现的改善。利用生物技术，已将诸如高产、除草剂耐受性和昆虫抗性的多种性状导入作物，导致全球农业和粮食安全的巨大进步。但是，此类生物技术产品中存在外来DNA会引发生物安全和环境问题。通过分离出任何整合的DNA，基因组编辑技术可用于生成靶基因组的位点特异性修饰，而在最终植物中不存在外来DNA。此外，通过瞬时表达，基因组编辑涉及瞬时编辑活性，以产生位点特异性修饰，而在过程的任何点没有DNA整合。基因组编辑的植物，特别是源自瞬时活性的那些，与常规的基因组修饰的植物有显著地不同，并且可能不会作为经遗传修饰的(GM)植物受到监管。基因组编辑技术(特别通过瞬时编辑方法)可以在农业中提供高度准确、安全和强大的植物育种和开发工具。然而，基于瞬时活性的基因组工程化面临更多挑战。与稳定转化相比，瞬时工程化通常会导致更少的修饰的细胞。在没有整合的可选择标志物时，鉴定工程化的细胞并在再生的植物中实现同质(homogenous)修饰是高度挑战的。这些挑战阻碍瞬时基因编辑作为改良植物的育种工具的常规实施。因此，非常需要增强基因组工程化效率的新方法和材料。
技术实现思路
在第一方面，提供了编码第一加强子多肽和第二加强子多肽的核酸，其中所述第一加强子多肽包含SEQIDNO：2的氨基酸序列或与SEQIDNO：2具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；和其中所述第二加强子多肽包含SEQIDNO：4、6或8中任一个的氨基酸序列，或与SEQIDNO：4、6或8中的任一个具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列。在本专利技术的第一方面的一个实施方案中，编码第一加强子多肽的核酸包含选自以下的编码序列：(i)包含SEQIDNO：1的核苷酸序列的核酸；(ii)包含与SEQIDNO：1具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列的核酸；和(iii)在严格杂交条件下与(i)或(ii)中定义的核酸的互补链杂交的核酸；和编码第二加强子多肽的核酸包含选自以下的编码序列：(I)包含SEQIDNO：3、5或7中任一个的核苷酸序列的核酸；(II)包含与SEQIDNO：3、5或7中的任一个具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列的核酸；和(III)在严格杂交条件下与(I)或(II)中定义的核酸的互补链杂交的核酸。在第二方面，提供了编码第三加强子多肽和第二加强子多肽的核酸，其中第三加强子多肽包含SEQIDNO：16、18或20的氨基酸序列，或与SEQIDNO：16、18或20具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；和其中第二加强子多肽包含SEQIDNO：4、6或8中任一个的氨基酸序列，或与SEQIDNO：4、6或8中的任一个具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列，其中在第三加强子多肽翻译后，前述第一加强子多肽的表达被激活；其中第一加强子多肽包含SEQIDNO：2的氨基酸序列或与SEQIDNO：2具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列。在本专利技术第二方面的一个实施方案中，编码第三加强子多肽的核酸包含选自以下的编码序列：(i)包含SEQIDNO：15、17或19中任一个的核苷酸序列的核酸；(ii)包含与SEQIDNO：15、17或19中的任一个具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列的核酸；和(iii)在严格杂交条件下与(i)或(ii)中定义的核酸的互补链杂交的核酸；和编码第二加强子多肽的核酸包含选自以下的编码序列：(I)包含SEQIDNO：3、5或7中任一个的核苷酸序列的核酸；(II)包含与SEQIDNO：3、5或7中的任一个具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列的核酸；和(III)在严格杂交条件与(I)或(II)中定义的核酸的互补链杂交的核酸。在另一方面，提供了重组基因，其包含在第一和/或第二方面中如上所定义的核酸。在本专利技术的一些实施方案中，编码第一加强子多肽的核酸可操作地连接至天然启动子或第一异源启动子，并且编码第二加强子多肽的核酸可操作地连接至天然启动子或第二异源启动子；其中编码第一加强子多肽的核酸和编码第二加强子多肽的核酸可操作地连接至一个异源启动子。在本专利技术的一些实施方案中，编码第二加强子多肽的核酸可操作地连接至该天然启动子或第一异源启动子，且编码第三加强子多肽的核酸可操作地连接至天然启动子或第二异源启动子；或编码第二加强子多肽的核酸和编码第三加强子多肽的核酸可操作地连接至一个异源启动子。在本专利技术的一些实施方案中，异源启动子可以是强组成型启动子、组织特异性启动子、发育特异性启动子或诱导型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.编码第一加强子多肽和第二加强子多肽的核酸，/n其中所述第一加强子多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；和/n其中所述第二加强子多肽包含SEQ ID NO：4、6或8中任一个的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：4、6或8中的任一个具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；或/n编码第三加强子多肽和第二加强子多肽的核酸，/n其中所述第三加强子多肽包含SEQ ID NO：16、18或20的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：16、18或20具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；和/n其中所述第二加强子多肽包含SEQ ID NO：4、6或8中任一项的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：4、6或8中的任一个具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列，/n其中在所述第三加强子多肽翻译后，所述第一加强子多肽的表达被激活；其中所述第一加强子多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180615 US 62/685,626;20180907 US 62/728,4011.编码第一加强子多肽和第二加强子多肽的核酸，
其中所述第一加强子多肽包含SEQIDNO：2的氨基酸序列或与SEQIDNO：2具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；和
其中所述第二加强子多肽包含SEQIDNO：4、6或8中任一个的氨基酸序列，或与SEQIDNO：4、6或8中的任一个具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；或
编码第三加强子多肽和第二加强子多肽的核酸，
其中所述第三加强子多肽包含SEQIDNO：16、18或20的氨基酸序列，或与SEQIDNO：16、18或20具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；和
其中所述第二加强子多肽包含SEQIDNO：4、6或8中任一项的氨基酸序列，或与SEQIDNO：4、6或8中的任一个具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列，
其中在所述第三加强子多肽翻译后，所述第一加强子多肽的表达被激活；其中所述第一加强子多肽包含SEQIDNO：2的氨基酸序列或与SEQIDNO：2具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列。


2.权利要求1的核酸，其中编码所述第一加强子多肽的核酸包含选自以下的编码序列：
(i)包含SEQIDNO：1的核苷酸序列的核酸；
(ii)包含与SEQIDNO：1具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列的核酸；和
(iii)在严格杂交条件下与(i)或(ii)中定义的核酸的互补链杂交的核酸；和
其中编码所述第二加强子多肽的核酸包含选自以下的编码序列：
(I)包含SEQIDNO：3、5或7中任一个的核苷酸序列的核酸；
(II)包含与SEQIDNO：3、5或7中的任一个具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列的核酸；和
(III)在严格杂交条件下与(I)或(II)中定义的核酸的互补链杂交的核酸，
其中编码所述第三加强子多肽的核酸包含选自以下的编码序列：
(1)包含SEQIDNO：15、17或19中任一个的核苷酸序列的核酸；
(2)包含与SEQIDNO：15、17或19中任一个具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列的核酸；和
(3)在严格杂交条件下与(1)或(2)中定义的核酸的互补链杂交的核酸。


3.一种重组基因，其包含权利要求1或2的核酸。


4.权利要求3的重组基因，其中编码所述第一加强子多肽的核酸可操作地连接至天然启动子或第一异源启动子，并且编码所述第二加强子多肽的核酸可操作地连接至天然启动子或第二异源启动子；或其中编码所述第一加强子多肽的核酸和编码所述第二加强子多肽的核酸可操作地连接至一个异源启动子；或
其中编码所述第二加强子多肽的核酸可操作地连接至天然启动子或第一异源启动子，且编码所述第三加强子多肽的核酸可操作地连接至天然启动子或第二异源启动子；或其中编码所述第二加强子多肽的核酸和编码所述第三加强子多肽的核酸可操作地连接至一个异源启动子。


5.权利要求4的重组基因，其中所述异源启动子是强组成型启动子、组织特异性启动子、发育特异性启动子或诱导型启动子。


6.一种DNA构建体，优选地为载体，其包含权利要求1或2的核酸或权利要求3至5中任一项的重组基因。


7.一种植物细胞，其包含权利要求1或2的核酸，权利要求3至5中任一项的重组基因或权利要求6的DNA构建体。


8.一种植物、其一部分或种子，其包含权利要求7的细胞。


9.一种在植物细胞中遗传修饰的方法，所述方法包含
(a)将以下导入所述植物细胞
(i)选自以下的组分：
(i.a)权利要求1或2的核酸，权利要求3至5中任一项的重组基因或权利要求6的DNA构建体；或
(i.b1)编码权利要求1中定义的第一加强子多肽的核酸；包含编码所述第一加强子多肽的核酸的重组基因，其优选地与权利要求4或5中定义的启动子可操作地连接；DNA构建体，优选地为载体，其包含编码权利要求1中定义的第一加强子多肽的核酸，或权利要求1中定义的第一加强子多肽；和
(i.b2)编码权利要求1中定义的第二加强子多肽的核酸；包含编码所述第二加强子多肽的核酸的重组基因，其优选地与权利要求4或5中定义的启动子可操作地连接，或DNA构建体，优选地为载体，其包含编码权利要求1中定义的第二加强子多肽的核酸，或权利要求1中定义的第二加强子多肽；或
(i.c1)编码适合于瞬时提高权利要求1中定义的第一加强子多肽的表达的定点转录激活子的核酸，或适合于瞬时提高权利要求1中定义的第一加强子多肽的表达的定点转录激活子；其中编码所述第一加强子多肽的核酸是内源核酸；和
(i.c2)编码适合于瞬时提高权利要求1中定义的第二加强子多肽的表达的定点转录激活子的核酸，或适合于瞬时提高权利要求1中定义的第二加强子多肽的表达的定点转录激活子；其中编码所述第一加强子多肽的核酸是内源核酸；或
(i.d)(i.b1)和(i.c2)的组合，或(i.b2)和(i.c1)的组合；和
(ii)感兴趣的转基因和/或基因组工程化组分；
(b)任选地，在允许所述第一加强子多肽和所述第二加强子多肽翻译的条件下，培养所述植物细胞，优选地与其中未导入(i.a)、(i.b1)和(i.b2)、(i.c1)和(i.c2)、或(i.d)的植物细胞相比所述翻译提高；和
(c)任选地，在允许在所述加强子多肽存在时通过所述感兴趣的转基因的整合或通过所述基因组工程化组分的活性来遗传修饰所述植物细胞的基因组的条件下，培养所述植物细胞；或
所述方法包含
(a)将以下导入植物细胞
(ii)选自以下的组分：
(i.a)权利要求1或2的核酸，权利要求3至5中任一项的重组基因或权利要求6的DNA构建体；或
(i.b1)编码权利要求1中定义的第三加强子多肽的核酸；包含编码所述第三加强子多肽的核酸的重组基因，其优选地与权利要求4或5中定义的启动子可操作地连接，DNA构建体，优选地为载体，其包含编码权利要求1中定义的第三加强子多肽的核酸，或权利要求1中定义的第三加强子多肽；和
(i.b2)编码权利要求1中定义的第二加强子多肽的核酸；包含编码所述第二加强子多肽的核酸的重组基因，其优选地与权利要求4或5中定义的启动子可操作地连接，或DNA构建体，优选地为载体，其包含编码权利要求1中定义的第二加强子多肽的核酸，或权利要求1中定义的第二加强子多肽，或
(i.c1)编码适合于瞬时提高权利要求1中定义的第三加强子多肽的表达的定点转录激活子的核酸，或适合于瞬时提高权利要求1中定义的第三加强子多肽的表达的定点转录激活子；其中编码所述第三加强子多肽的核酸是内源核酸；和
(i.c2)编码适合于瞬时提高权利要求1中定义的第二加强子多肽的表达的定点转录激活子的核酸，或适合于瞬时提高权利要求1中定义的第二加强子多肽的表达的定点转录激活子；其中编码所述第二加强子多肽的核酸是内源核酸；或
(i.d)(i.b1)和(i.c2)的组合，或(i.b2)和(i.c1)的组合；或
(iii)感兴趣的转基因和/或基因组工程化组分；
(b)任选地，在允许所述第三加强子多肽和所述第二加强子多肽翻译的条件下，培养所述植物细胞，优选地与其中未导入(i.a)、(i.b1)和(i.b2)、(i.c1)和(i.c2)、或(i.d)的植物细胞相比所述翻译提高；和
(c)任选地，在允许在所述加强子多肽存在时通过所述感兴趣的转基因的整合或通过所述基因组工程化组分的活性来遗传修饰所述植物细胞的基因组的条件下，培养所述植物细胞。


10.权利要求9的方法，其中来自(i)的组分的第一加强子多肽和第二加强子多肽或第二加强子多肽和第三加强子多肽在所述植物细胞中是瞬时存在的、是瞬时有活性的或是瞬时表达的，或其中组分(i)在所述植物细胞中是瞬时存在的、是瞬时有活性的或是瞬时表达的。


11.权利要求9或10的方法，其中在步骤(i)中，额外地将一个或多个选自PLT5多肽、KWS-RBP1多肽、RKD4多肽和RKD2多肽的多肽，和/或一个或多个选自编码PLT5多肽、KWS-RBP1多肽、RKD4多肽和RKD2多肽的核酸的核酸，和/或一个或多个适合于瞬时提高内源性PLT5多肽、内源性RKD4多肽或内源性RKD2多肽的表达的定点转录激活子，和/或编码这种定点转录激活子的核酸导入所述植物细胞。


12.权利要求11的方法，其中所述PLT5多肽、所述KWS-RBP1多肽、所述RKD4多肽和所述RKD2多肽在所述植物细胞中是瞬时存在的、是瞬时有活性的或是瞬时表达的，或其中编码所述PLT5多肽、所述KWS-RBP1多肽、所述RKD4多肽和所述RKD2多肽的核酸在所述植物细胞中是瞬时存在的、是瞬时有活性的或是瞬时表达的。


13.权利要求12的方法，其中将所述第一加强子多肽和所述第二加强子多肽以及所述PLT5多肽导入所述植物细胞中，并任选地是瞬时共同表达的；和/或其中将所述第一加强子多肽和所述第二加强子多肽以及所述KWS-RBP1多肽导入所述植物细胞中，并任选地是瞬时共同表达的；和/或其中将所述第一加强子多肽和所述第二加强子多肽和所述RKD4多肽导入所述植物细胞中，并任选地是瞬时共同表达的，和/或其中将所述第一加强子多肽和所述第二加强子多肽和所述RKD2多肽导入所述植物细胞中，并任选地是瞬时共同表达的。


14.权利要求11至13中任一项的方法，其中所述PLT5多肽包含SEQIDNO：10或12的氨基酸序列，或与SEQIDNO：10或12具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；或其中编码所述PLT5多肽的核酸编码SEQIDNO：10或12的氨基酸序列，或编码与SEQIDNO：10或12具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；或其中所述KWS-RBP1多肽包含SEQIDNO：14的氨基酸序列，或与SEQIDNO：14具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；或其中编码所述KWS-RBP1多肽的核酸编码SEQIDNO：14的氨基酸序列，或编码与SEQIDNO：14具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、9...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔吉祥，孟玲，
申请(专利权)人：科沃施种子欧洲股份两合公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE