靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2的高亲和力单克隆抗体及其用途制造技术

描述了以高亲和力结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑2(GPC2)的单克隆抗体。进一步描述了包括公开的抗体或其抗原结合片段的免疫毒素和嵌合抗原受体(CAR)。在某些情况下，抗体或抗原结合片段是人源化的。公开的GPC2特异性抗体和偶联物可用于例如，诊断或治疗GPC2阳性癌症，包括神经母细胞瘤、髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2的高亲和力单克隆抗体及其用途相关申请的交叉引用本申请要求2018年8月8日提交的美国临时申请号62/716,169的权益，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。
本公开涉及特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2的单克隆抗体及其用途，例如用于治疗儿科癌症。致谢政府支持本专利技术是在国立卫生研究院授予的项目编号Z01BC010891的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。
技术介绍
神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤。它来自交感神经系统的神经内分泌组织，占美国儿童期癌症的8-10％(MarisandHogarty,Lancet369:2106-2120,2007)。神经母细胞瘤是一种复杂的异质性疾病，即使使用密集的多模式治疗，近50％的患者具有高风险表型，其特征是癌症广泛传播且长期生存率较差(Yuetal.,NewEnglJMed363:1324-1334,2010)。接受标准疗法的患者中约有45％复发并最终死于转移性疾病(Matthayetal.,NewEnglJMed341:1165-1173,1999)。因此，迫切需要安全且有效地治疗神经母细胞瘤。治疗神经母细胞瘤和其他致命实体瘤的最困难挑战之一是缺乏肿瘤特异性靶标。已经表明，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)mRNA在神经母细胞瘤和其他儿科癌症中高表达(Orentasetal.,FrontOncol2:194,2012)。GPC2属于六成员人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白家族，它们通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着到细胞表面(Filmusetal.,GenomeBiol9:224,2008)。不同于其他已知的磷脂酰肌醇蛋白聚糖，GPC2在神经系统中独特表达(Stippetal.,JCellBiol124:149-160,1994)，参与细胞粘附并被认为调节轴突的生长和引导。
技术实现思路
本公开描述了通过小鼠杂交瘤技术分离的两种高亲和力GPC2特异性单克隆抗体。GPC2抗体(称为CT3和CT5)特异性结合GPC2，但不特异性结合其他磷脂酰肌醇蛋白聚糖。由公开的抗体组成的免疫毒素和嵌合抗原受体(CAR)T细胞能够有效杀死GPC2阳性肿瘤细胞。本文提供了结合(例如特异性结合)GPC2的单克隆抗体(或抗原结合片段)。在一些实施方案中，单克隆抗体或抗原结合片段包括CT3或CT5的互补决定区(CDR)序列。本文还提供了包含公开的单克隆抗体或抗原结合片段的偶联物。在一些实例中，提供了包括本文公开的单克隆抗体或抗原结合片段的免疫偶联物、CAR、多特异性抗体、抗体-药物偶联物(ADC)、抗体-纳米颗粒、偶联物或融合蛋白。本公开内容还提供了包括GPC特异性单克隆抗体或抗原结合片段和药学上可接受的运载体(carrier)的组合物。本文还提供了编码本文公开的GPC2特异性单克隆抗体或抗原结合片段、免疫偶联物、CAR、多特异性抗体和融合蛋白的核酸分子和载体(vector)。还提供了编码GPC2特异性CAR和截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)的核酸构建体。编码的CAR包括与细胞外铰链区、跨膜区、细胞内共刺激结构域和细胞内信号传导结构域融合的GPC2特异性单克隆抗体片段(例如scFv)。huEGFRt包含两个EGFR细胞外结构域(结构域III和结构域IV)和EGFR跨膜结构域，但缺少两个膜远端细胞外结构域和所有细胞内结构域。在一些实施方案中，所述核酸分子在5'至3'方向上包括编码第一信号序列的核酸；编码GPC2特异性抗体或其抗原结合片段的核酸；编码细胞外铰链区的核酸；编码跨膜结构域的核酸；编码细胞内共刺激结构域的核酸；编码细胞内信号传导结构域的核酸；编码自切割2A肽的核酸；编码第二信号序列的核酸；以及编码huEGFRt的核酸。还提供了载体，例如病毒载体，其包括本文公开的核酸分子。还公开了共表达所公开的CAR和huEGFRt的分离细胞，例如T淋巴细胞。还提供了治疗受试者中的GPC2阳性癌症的方法，以及抑制受试者中的GPC2阳性癌症的肿瘤生长或转移的方法。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用本文公开的单克隆抗体或抗原结合片段，或向受试者施用包含本文公开的单克隆抗体或抗原结合片段的免疫偶联物、CAR、ADC、多特异性抗体、抗体-纳米颗粒偶联物或融合蛋白。本文进一步提供了检测样品中GPC2表达的方法。在一些实施方案中，该方法包括将样品与本文公开的单克隆抗体或抗原结合片段接触，并检测抗体与样品的结合。还提供了诊断受试者患有GPC2阳性癌症的方法。在一些实施方案中，该方法包括将从受试者获得的样品与本文公开的单克隆抗体或抗原结合片段接触，并检测抗体与样品的结合。从下面参照附图进行的详细描述，本公开的前述和其他目的和特征将变得更加明显。附图说明图1A：CT3和CT5与GPC2和其他磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白的结合的ELISA分析。两种抗体都特异性结合GPC2。图1B：CT3与人磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白(huGPC1、huGPC2、huGPC3、huGPC4、huGPC5和huGPC6)和小鼠GPC2(msGPC2)的结合的ELISA分析。CT3抗体特异性结合人GPC2。图1C：针对CT3抗体与人GPC2之间相互作用的八隅体动力学分析。CT3以高亲和力(KD＝0.5nM)结合GPC2。图2A：通过流式细胞术确定的GPC2阳性神经母细胞瘤细胞系LAN1和IMR5的细胞表面GPC2表达。白色峰代表同种型对照抗体对细胞表面的染色，黑色峰代表CT5抗体对细胞表面的染色。10μg/ml下的CT5用于染色。图2B：CT3抗体与细胞表面上的人GPC2的特异性结合。不表达GPC2的A431细胞用作对照。G10是GPC2过表达的A431细胞系。F8是GPC2过表达的IMR5细胞系。标记为“1”的峰代表同种型对照抗体对细胞表面的染色，标记为“2”的峰代表抗GPC2抗体CT3对细胞表面的染色。CT3特异性识别在细胞表面上表达的GPC2。图3：人神经母细胞瘤肿瘤中的GPC2表达。如通过免疫组织化学测定的，GPC2在神经母细胞瘤(i至iv)和正常神经(v和vi)组织中的表达。用1μg/mlCT3抗体标记组织。图4：人髓母细胞瘤肿瘤中的GPC2表达。通过免疫组织化学测定，GPC2在成神经管细胞瘤肿瘤(i至iv)和正常脑组织(v和vi)中的表达。用1μg/mlCT3抗体标记组织。图5：GPC2在人视网膜母细胞瘤肿瘤中的表达。通过免疫组织化学测定，GPC2在视网膜母细胞瘤肿瘤(i至iv)和癌旁眼(v和vi)组织中的表达。用1μg/mlCT3抗体标记组织。图6：GPC2在人正常组织中的表达。如通过免疫组织化学测定的，GPC2在人正常组织(包括脑、心脏、肺、肝、胃、小肠、结肠、胰腺、脾脏、肾脏和皮肤)中的表达。用1μg/mlCT3抗体标记组织。在任何正常组织中均未检测到明显的GPC2染色。图7A-7E：靶向GPC2的CT3CART细胞杀死神经本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域，其中：/n所述VH结构域包含SEQ ID NO:2的CDR序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:4的CDR序列；或/n所述VH结构域包含SEQ ID NO:6的CDR序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:8的CDR序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180808 US 62/716,1691.一种结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域，其中：
所述VH结构域包含SEQIDNO:2的CDR序列且所述VL结构域包含SEQIDNO:4的CDR序列；或
所述VH结构域包含SEQIDNO:6的CDR序列且所述VL结构域包含SEQIDNO:8的CDR序列。


2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述CDR序列是使用Kabat、IMGT或Paratome编号方案或Kabat、IMGT和Paratome编号方案的组合定义的。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH结构域包含SEQIDNO:2的残基31-35、50-66和99-112且所述VL结构域包含SEQIDNO:4的残基24-33、49-55和88-96；或
所述VH结构域包含SEQIDNO:6的残基31-35、50-68和101-109且所述VL结构域包含SEQIDNO:8的残基24-34、50-56和89-96。


4.根据权利要求1或权利要求2所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH结构域包含SEQIDNO:2的残基26-33、51-58和97-112且所述VL结构域包含SEQIDNO:4的残基27-31、49-51和88-96；或
所述VH结构域包含SEQIDNO:6的残基26-33、51-60和99-109且所述VL结构域包含SEQIDNO:8的残基27-32、50-52和89-96。


5.根据权利要求1或权利要求2所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH结构域包含SEQIDNO:2的残基26-35、47-61和97-112且所述VL结构域包含SEQIDNO:4的残基27-33、45-55和88-95；或
所述VH结构域包含SEQIDNO:6的残基27-35、47-62和99-109且所述VL结构域包含SEQIDNO:8的残基27-34、46-56和89-95。


6.根据权利要求1或权利要求2所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH结构域包含SEQIDNO:2的残基26-35、47-66和97-112且所述VL结构域包含SEQIDNO:4的残基24-33、45-55和88-96；或
所述VH结构域包含SEQIDNO:6的残基26-35、47-68和99-109且所述VL结构域包含SEQIDNO:8的残基27-34、46-56和89-96。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中VH结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少95％同一性和/或所述VL结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:4具有至少95％同一性。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述VH结构域的氨基酸序列包含SEQIDNO:2或由其组成和/或所述VL结构域的氨基酸序列包含SEQIDNO:4或由其组成。


9.根据权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中VH结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:6具有至少95％同一性和/或所述VL结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:8具有至少95％同一性。


10.根据权利要求1-7中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述VH结构域的氨基酸序列包含SEQIDNO:6或由其组成和/或所述VL结构域的氨基酸序列包含SEQIDNO:8或由其组成。


11.根据权利要求1-10中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其为人源化单克隆抗体或抗原结合片段。


12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是单链可变片段(scFv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab)’2片段或二硫键稳定的可变片段(dsFv)。


13.根据权利要求12所述的抗原结合片段，其为scFv。


14.根据权利要求13所述的抗原结合片段，其中所述scFv包含SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、或SEQIDNO:21的氨基酸序列。


15.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段。


16.根据权利要求15所述的CAR，其进一步包含铰链区、跨膜结构域、共刺激信号传导部分、信号传导结构域或其任何组合。


17.根据权利要求16所述的CAR，其中所述铰链区包括CD8α铰链区。


18.根据权利要求16或权利要求17所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。


19.根据权利要求16-18中任一项所述的CAR，其中所述共刺激信号传导部分包括4-1BB信号传导部分。


20.根据权利要求16-19中任一项所述的CAR，其中所述信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域。


21.根据权利要求15-20中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合片段是包含SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、或SEQIDNO:21的氨基酸序列的scFv。


22.一种分离细胞，其表达权利要求15-21中任一项所述的CAR。


23.根据权利要求22所述的分离细胞，其是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。


24.一种免疫偶联物，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段和效应器分子。


25.根据权利要求24所述的免疫偶联物，其中所述效应器分子是毒素。


26.根据权利要求25所述的免疫偶联物，其中所述毒素是假单胞菌外毒素或其变体。


27.根据权利要求26所述的免疫偶联物，其中所述假单胞菌外毒素变体是PE38。


28.根据权利要求24所述的免疫偶联物，其中所述效应器分子是可检测标记物。


29.根据权利要求28所述的免疫偶联物，其中所述可检测标记物包括荧光团、酶或放射性同位素。


30.一种抗体-药物偶联物(ADC)，其包含与权利要求1-14中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段偶联的药物。


31.根据权利要求30所述的ADC，其中所述药物是小分子。


32.根据权利要求30或权利要求31所述的ADC，其中所述药物是抗微管剂、抗有丝分裂剂和/或细胞毒性剂。


33.一种多特异性抗体，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段和至少一种另外的单克隆抗体或其抗原结合片段。


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【专利技术属性】
技术研发人员：何苗壮，B·D·弗莱明，李楠，
申请(专利权)人：美国政府由卫生和人类服务部的部长所代表，
类型：发明
国别省市：美国;US