基于Cy5标记配体的NanoBRET受体结合药物筛选系统技术方案

本发明专利技术提供了基于Cy5及其衍生物Sulfo‑Cy5荧光标记配体的NanoBRET受体结合高通量药物筛选系统，所述药物筛选系统包括Cy5及其衍生物Sulfo‑Cy5荧光标记配体和表达NanoLuc融合G蛋白偶联受体的工程化细胞。本发明专利技术将NanoLuc融合于受体的N端构建NanoLuc融合受体，配对Cy5及其衍生物Sulfo‑Cy5荧光标记的肽类、蛋白质或小分子配体，创立了价廉且灵敏的NanoBRET高通量受体药物筛选系统。

【技术实现步骤摘要】
基于Cy5标记配体的NanoBRET受体结合药物筛选系统
本专利技术属于生物
，涉及基于Cy5或Sulfo-Cy5标记配体的NanoBRET受体结合药物筛选系统，尤其涉及基于Cy5及其衍生物Sulfo-Cy5荧光标记配体的NanoBRETG蛋白偶联受体结合高通量药物筛选系统。
技术介绍
G蛋白偶联受体(GPCRs)是人类基因组中最大的膜蛋白超家族，广泛分布于神经系统、内分泌系统、心血管系统及免疫系统等几乎所有的器官和组织中，介导神经递质和激素的细胞信号转导，参与调节细胞发育、分化和正常的生理功能活动，与多种疾病的发生、发展密切相关。在目前的临床用药中，有约40％的药物作用于GPCRs，但是只有少数的GPCRs具有相应的临床药物(HAUSER,A.S.,CHAVALI,S.,MASUHO,I.,JAHN,L.J.,MARTEMYANOV,K.A.,GLORIAM,D.E.&BABU,M.M.2018.PharmacogenomicsofGPCRDrugTargets.Cell,172,41-54)，因此GPCRs仍然是最重要的药物开发靶点之一(SANTOS,R.,URSU,O.,GAULTON,A.,BENTO,A.P.,DONADI,R.S.,BOLOGA,C.G.,KARLSSON,A.,AL-LAZIKANI,B.,HERSEY,A.,OPREA,T.I.&OVERINGTON,J.P.2017.Acomprehensivemapofmoleculardrugtargets.NatureReviewsDrugDiscovery,16,19-34.；HAUSER,A.S.,ATTWOOD,M.M.,RASK-ANDERSEN,M.,SCHIOTH,H.B.&GLORIAM,D.E.2017.TrendsinGPCRdrugdiscovery:newagents,targetsandindications.NatRevDrugDiscov,16,829-842.；NIETOGUTIERREZ,A.&MCDONALD,P.H.2018.GPCRs:Emerginganti-cancerdrugtargets.CellularSignaling,41,65-74.)。目前靶向GPCRs的药物研发正在进一步加速。新药研发的关键问题之一是开发创新的高通量配体鉴定方法，以发现小分子化合物、多肽或蛋白质与受体的结合特性及其药理活性。传统的放射性配体受体结合实验由于存在放射性危害，需要过滤、洗涤去除游离的放射性配体，不适用于高通量药物筛选。时间分辨荧光能量共振转移(TR-FRET)是近年来新兴的受体结合分析技术(EMAMI-NEMINI,A.,ROUX,T.,LEBLAY,M.,BOURRIER,E.,LAMARQUE,L.,TRINQUET,E.&LOHSE,M.J.2013.Time-resolvedfluorescenceligandbindingforGprotein–coupledreceptors.NatureProtocols,8,1307.)。Cisbio公司的Tag-Lite专利技术将SNAP融合到GPCRs的N末端，形成SNAP-GPCRs，而SNAP可被含有镧系元素铽的荧光基团(Lumi4-Tb)共价标记，从而在细胞膜上得到荧光标记的受体，通过检测激发受体的荧光基团与加入的荧光配体之间的FRET信号，来测定受体与配体的结合能力。但是这一方法也存在一些缺陷，如费用高昂、本底值高，另外分子内激发过程(电子转移、FRET、光漂白)以及化合物或蛋白的荧光外部相互作用会对受体或配体产生淬灭效应等，限制了它的广泛应用。NanoBRET是Promega公司于2015年推出的用于检测蛋白质间相互作用的最新技术。与上述荧光共振能量转移技术(FRET)相比，生物发光共振能量转移技术(BRET)存在诸多优点：无需激发光，背景/本底值低，有效避免了光漂白和自发荧光等问题，是目前为数不多的能够用于研究细胞内分子间相互作用的技术。NanoBRET技术的出现，完美解决了传统BRET技术的应用痛点(如RLuc光输出量低，存在较高光谱重叠所致的高背景/检测噪音等)。NanoBRET使用分子量仅为19kDa(171个氨基酸)的NanoLuc荧光素酶作为能量供体，配合Promega配套的618荧光基团(可与融合的HaloTag蛋白结合)受体，NanoLuc供体发出明亮的蓝移发光信号(比RLuc高两个数量级)，耦合到远红移的HaloTag受体上，光谱叠加效果佳、信号强，比传统BRET的本底值更低(MACHLEIDT,T.,WOODROOFE,C.C.,SCHWINN,M.K.,,J.,ROBERS,M.B.,ZIMMERMAN,K.,OTTO,P.,DANIELS,D.L.,KIRKLAND,T.A.&WOOD,K.V.2015.NanoBRET—ANovelBRETPlatformfortheAnalysisofProtein–ProteinInteractions.ACSChemicalBiology,10,1797-1804.)，显著提高了检测灵敏度，非常适合细胞水平蛋白质相互作用的研究。最近NanoBRET已被成功用于检测GPCRs与不同G蛋白的偶联效应(MASUHO,I.,OSTROVSKAYA,O.,KRAMER,G.M.,JONES,C.D.,XIE,K.&MARTEMYANOV,K.A.2015.DistinctprofilesoffunctionaldiscriminationamongGproteinsdeterminetheactionsofGprotein–coupledreceptors.ScienceSignaling,8,ra123-ra123.)以及β肾上腺素受体与BODIPY-630/650标记的β肾上腺素受体小分子拮抗剂之间的结合特性(STODDART,L.A.,JOHNSTONE,E.K.M.,WHEAL,A.J.,GOULDING,J.,ROBERS,M.B.,MACHLEIDT,T.,WOOD,K.V.,HILL,S.J.&PFLEGER,K.D.G.2015.ApplicationofBRETtomonitorligandbindingtoGPCRs.NatMeth,12,661-663.)。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了基于Cy5及其衍生物Sulfo-Cy5荧光标记配体的NanoBRET受体结合高通量药物筛选系统，以Cy5或其衍生物Sulfo-Cy5荧光标记多肽作为配体，与N端融合表达NanoLuc标签的受体相互结合，建立了受体高通量药物筛选系统，实现了灵敏且廉价的受体高通量药物筛选。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种药物筛选系统，所述药物筛选系统包括荧光标记配体和表达NanoLuc融合受体的工程化细胞。本专利技术中，将NanoLuc融合表达于受体的N端构建N本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种药物筛选系统，其特征在于，所述药物筛选系统包括荧光标记配体和表达NanoLuc融合受体的工程化细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种药物筛选系统，其特征在于，所述药物筛选系统包括荧光标记配体和表达NanoLuc融合受体的工程化细胞。


2.根据权利要求1所述的药物筛选系统，其特征在于，所述药物筛选系统包括荧光标记配体和表达NanoLuc融合G蛋白偶联受体的工程化细胞，所述配体包括G蛋白偶联受体的激动剂和/或拮抗剂；
优选地，所述荧光标记配体的荧光标记基团包括Cy5或其衍生物Sulfo-Cy5。


3.根据权利要求1或2所述的药物筛选系统，其特征在于，所述Cy5荧光标记配体包括Sulfo-Cy5荧光标记改造型促性腺激素释放激素或Sulfo-Cy5荧光标记Kisspeptin及其变体；
优选地，所述改造型促性腺激素释放激素为将野生型促性腺激素释放激素I的第六位Gly取代改变为D-Lys；
优选地，所述Sulfo-Cy5荧光标记在所述改造型促性腺激素释放激素的第六位D-Lys上；
优选地，所述Sulfo-Cy5荧光标记改造型促性腺激素释放激素的结构式如式I所示；





4.根据权利要求1-3任一项所述的药物筛选系统，其特征在于，所述NanoLuc融合G蛋白偶联受体包括NanoLuc融合促性腺激素释放激素受体，优选为NanoLuc融合人突变型促性腺激素释放激素受体；
优选地，所述NanoLuc融合G蛋白偶联受体包括NanoLuc融合G蛋白偶联受体54；
优选地，所述NanoLuc融合在所述G蛋白偶联受体的N端；
优选地，所述NanoLuc融合人突变型促性腺激素释放激素受体为NanoLuc融合在第191位赖氨酸缺失突变型促性腺激素释放激素受体的N端。


5.根据权利要求1-4任一项所述的药物筛选系统，其特征在于，所述Sulfo-Cy5荧光标记配体在所述药物筛选系统中的终浓度为1～50nM；
优选地，所述表达NanoLuc融合受体的工程化细胞在所述药物筛选系统中的终浓度为5×1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕志良，沈力，孟佳，荣荣，
申请(专利权)人：西交利物浦大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32