一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术组合敲除水稻的感病基因，从而提高水稻抗稻瘟病和白叶枯病的能力。本发明专利技术公开了水稻3个感病相关基因组合敲除突变体材料，证实了bxp三敲突变体材料不仅提高了水稻对稻瘟病菌的抗性，还提高了对白叶枯病的抗性，而且相比单突变，三突变体的抗病性水平存在叠加效应。在实现广谱抗病的同时，bxp三敲突变体与对照相比农艺性状无明显变化。

【技术实现步骤摘要】
一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用。
技术介绍
植物病害严重影响全球农作物的产量和品质。在农业生产过程中，作物在同一个成长季节往往相继或者同时受到两种或两种以上病原菌的侵染，因此提高作物的广谱抗病性对作物的高产和稳产具有重要意义。水稻是世界三大粮食作物之一，也是我国最重要的粮食作物，水稻生产对我国粮食安全具有基石的作用。白叶枯病(Bacterialeafblight)和稻瘟病(Riceblast)分别被认为是水稻最严重的细菌性病害和最具破坏性的真菌病害之一，严重威胁着水稻的产量和品质，在田间往往相继发生。培育同时提高对稻瘟病和白叶枯病抗病性的水稻品种是育种家的重要目标。与抗病基因(Rgene)赋予小种特异的抗性不同，感病基因(Sgene)被认为是病原菌成功侵染病原体所需的关键因素。随着病原菌的不断进化，抗病基因往往会失去功效。因此，破坏感病基因的表达成为改善寄主抗性的一个方向。自从2002年在拟南芥中鉴定出pmr6(白粉病抗性)后，一种基于基因功能丧失而形成的新型抗病性概念就此产生，在此基础上提出了感病基因这一概念。同时，随着基因编辑技术的发展，使植物感病基因的编辑变得更加高效易行，提高植物抗性的需求使S基因编辑成为当前研究的热点。作为一个典型的代表，70年前，感病基因Mlo的功能丧失被证明对大麦具有抗白粉病的能力，而且这种突变体至今仍然被使用，具体表现为对田间所有的白粉菌小种都具有抗性。最近，TALEN和CRISPR-Cas9技术同时编辑的六倍体面包小麦的三个MLO等位基因赋予了小麦对白粉病的广谱抗性。有研究表明，利用CRISPR/Cas9技术在拟南芥eIF(iso)4E位点引入序列特异性点突变，赋予了拟南芥对芜菁花叶病毒(TuMV)的完全抗性。同样的技术被用于编辑黄瓜(CucumissativusL.)的eIF4E基因，达到对抗病毒的效果。除了病毒和真菌病原体外，感病基因也被用来激发对重要细菌病原体的免疫。CRISPR/Cas9介导的CsLOB1启动子编辑赋予了Wanjinchengorange对柑桔溃疡病的高度抗性，另一研究组利用CRISPR/Cas9技术对邓肯柚溃疡病易感基因CsLOB1也进行了编辑，编辑后的植株表现出很好的抗溃疡病的效果。在水稻中，CRISPR基因组编辑工具最初是对SWEET11和SWEET14进行编辑，基因编辑的植株表现出对白叶枯的持久抗性。以上研究表明，通过基因编辑技术改造寄主的感病基因是创制抗病种质的一条快捷可行的策略。当前已经鉴定了不同病原菌在作物中一系列的感病基因，通过基因编辑技术已经创制了不少抗相应病原菌的作物新种质。但是聚合编辑这些感病基因是否可以同时增强对不同病原菌的抗病性？聚合这些感病基因对同一种病原菌的抗病水平是否有叠加的效应？聚合这些抗病基因是否会影响作物的正常生长？这些问题是在作物中应用感病基因迫切需要解决的问题。基于现有报道，已经鉴定到了稻瘟菌和白叶枯菌在水稻中的一系列感病基因。如稻瘟菌感病基因Bsrd1和Pi21的敲除突变体材料都部分提高了水稻对稻瘟菌的抗病性，白叶枯菌的感病基因Xa5的突变体材料部分提高了对白叶枯菌的抗病性，但是这三个感病基因的抗病水平尚不足以单独用于抗病材料的创制。此外，Pi21和Xa5通常以单个数量性状的形式与其他基因聚合用于抗病分子育种，但这种方式所耗费的年限较长。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：如何利用基因编辑技术，快速创制水稻广谱抗病新材料，减少稻瘟病和白叶枯病危害。为培育水稻广谱抗病新品种和开发新的病害防治策略提供保障。本专利技术的技术方案为：一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用，通过基因编辑技术组合敲除水稻的感病基因Bsrd1、Xa5和Pi21，从而提高水稻抗稻瘟病和白叶枯病的能力。进一步地，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9。进一步地，CRISPR/Cas9基因编辑技术组合敲除所使用的引物如下：引物对Bsrd1-F/Bsrd1-R，引物对Xa5-F/Xa5-R，引物对Pi21-F/Pi21-R；Bsrd1-F核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，Bsrd1-R核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，Xa5-F核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，Xa5-R核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，Pi21-F核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，Pi21-R核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。进一步地，具体步骤为：(1)sgRNA引物设计根据CRISPR/Cas9靶位点设计原则，针对水稻的感病基因Bsrd1、Xa5和Pi21选择靶位点序列，设计出三个基因的引物，并在Bsrd1正向和反向引物的5’端加上内切酶BsaI,Xa5正向和反向引物的5’端加上内切酶BtgZI的接头,Pi21正向和反向引物的5’端分别加上内切酶BsaI和BtgZI，引物序列如下表：(2)将引物退火；(3)消化载体①先用BsaI酶切pENTR4-gRNA4，采用T4连接酶与Bsrd1引物连接后再用BtgZI酶切pENTR4-gRNA5与Xa5引物连接；②用BsaI和BtgZI双酶切pENTR4-gRNA5，与Pi21连接；③HindIII酶切①和②的载体，将三个靶序列都连接至pENTR4-gRNA5；④Gateway反应，将pENTR4-gRNA5的片段转移至pBY02-OsCas9-ccdB载体；(4)转化感受态细胞，转化农杆菌后接种水稻。本专利技术为使用基因编辑技术组合敲除感病基因创制广谱抗病材料带来启示。一方面，敲除或沉默单个感病基因对抗性水平的影响往往有限，随着病原菌的不断进化将雇佣新的感病基因，使寄主抗性丧失；另一方面，单个基因的抗谱相对较窄，像Xa5敲除材料只对白叶枯表现部分抗性，Bsrd1和Pi21敲除材料只对稻瘟病有部分抗性。我们通过组合敲除上述三个感病基因得到抗性水平更高，抗谱更广的材料。更有趣的是，我们的三敲除体材料并未对关键农艺性状产生影响，使得这个材料拥有潜在的应用价值。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术公开了水稻3个感病相关基因Bsrd1,Xa5和Pi21组合敲除突变体材料，证实了bxp三敲突变体材料不仅提高了水稻对稻瘟病菌的抗性，还提高了对白叶枯病的抗性，而且相比单突变，三突变体的抗病性水平存在协同效应。在实现广谱抗病的同时，bxp三敲突变体与对照相比农艺性状无明显变化。2、本专利技术揭示CRISPR技术组合编辑水稻感病基因达到广谱抗病存在可行性，对如何开发利用CRISPR创制水稻广谱抗病材料具有指导意义。3、本专利技术为敲除植物感病基因应用于其它作物带来启示，组合编辑作物上的多个感病基因从而达到多重病原菌抗性的效果。附图说明图1为对照与Pi21和Bsrd1单敲除体接种稻瘟菌和对照与Xa5接种白叶枯菌的对比图；图中NPB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用，其特征在于，通过基因编辑技术组合敲除水稻的感病基因Bsrd1、Xa5和Pi21，从而提高水稻抗稻瘟病和白叶枯病的能力。/n

【技术特征摘要】
1.一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用，其特征在于，通过基因编辑技术组合敲除水稻的感病基因Bsrd1、Xa5和Pi21，从而提高水稻抗稻瘟病和白叶枯病的能力。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，CRISPR/Cas9基因编辑技术组合敲除所使用的引物如下：引物对Bsrd1-F/Bsrd1-R，引物对Xa5-F/Xa5-R，引物对Pi21-F/Pi21-R；Bsrd1-F核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，Bsrd1-R核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，Xa5-F核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，Xa5-R核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，Pi21-F核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，Pi21-R核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。


4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体步骤为：
(1)sgRNA引物设计
根据CRISPR/Cas9靶位点设计原则，针对水稻的感病基因Bsrd1、Xa5和Pi21选择靶位点序列，设计出三个基因的引物，并在Bsrd1正向和反向引物的5’端加上内切酶BsaI,Xa5正向和反向引物的5’端加上内切酶BtgZI的接头,Pi21正向和反向引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：宁约瑟，陶辉，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11