能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌及构建方法技术

本发明专利技术公开了能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌及构建方法，其构建方法方法为：(1)分别构建载体pSI‑ggpP，pSI‑ggpS和pSI‑ggpPS：(2)构建载体pSI‑2522ggpPS：(3)构建下调蔗糖合成载体pSII‑drfbA：(4)将载体pSI‑2522ggpPS和pSII‑drfbA依次转入聚球藻UTEX 2973中，获得能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌。实验证明，本发明专利技术的基因工程菌株最终GG产率为1.3mg/L/H，且在0.5M NaCl条件下，比对照菌株提高62％。这对利用光合微生物生产GG及提高Syn2973耐盐性具有重要的理论及实际意义。

【技术实现步骤摘要】
能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌及构建方法
本专利技术属于工业微生物领域，具体涉及能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌及构建方法及应用。
技术介绍
盐度是重要的非生物因子，尤其是对于水生生物。为了在高盐度环境中生存，生物必须调整其内部水势并避免盐离子毒性。适应外部高盐度环境，生物主要通过相容性溶质的积累和离子的主动输出。相容性溶质是一类低分子质量的有机化合物，易溶于水，一般不带净电荷，在高渗透或盐胁迫下在细胞内高浓度积聚，而不干扰新陈代谢。在盐胁迫细胞中相容性溶质的积累主要用来弥补水势的差异，帮助细胞吸水，建立或维持膨胀压力。蓝细菌的耐盐性与相容性物质的合成密切相关。GG(甘油葡萄糖苷)，是一类由甘油与葡萄糖分子以糖苷键结合而成的物质，可以在中度耐盐(嗜盐)蓝细菌、某些异养细菌和真菌中，从头合成以抵抗盐胁迫。GG的甜度比蔗糖高0.55倍，热稳定性高，热着色性低，吸湿性低，保水能力高。它是一种大分子的稳定剂，可用于蛋白质药物等的长期保存，还可作为化妆品添加剂，保健食品原料和治疗剂等。近年来，GG的生物合成在不同微生物中进行了探索。与化学合成和酶催化相比，使用微生物作为生物催化剂具有原料灵活，可以通过基因工程有效地改造生成合成所需的前体。蓝细菌(Cyanobacteria)，是地球上最早出现的能够利用光和二氧化碳作为唯一能源和碳源的革兰氏阴性光合微生物。近年来，合成生物学策略和工具的出现和应用使得改造蓝细菌成为一种替代传统石油基础生产的可再生生物燃料和化学品底盘细胞的可行性选择，如合成乙醇(5.50g/L)，异戊二烯(1.26g/L)，聚羟基丁酸酯(1.16g/L)和3-羟基丙酸(837.18mg/L)。更重要的是，与其他光合微藻相比，蓝细菌具有易于遗传操作和相对较快生长速度的优势。但是，目前蓝细菌的生产力仍低于传统异养模式菌株如大肠杆菌和酿酒酵母，其中，最主要的瓶颈是蓝细菌的生长速度较慢。例如，集胞藻PCC6803在300μmolphotonsm-2s-1，3％二氧化碳，和30℃培养条件下倍增时间为6.6小时，而以空气中二氧化碳为碳源，倍增时间长达12小时，而聚球藻PCC7942和聚球藻PCC7002的倍增时间分别为4.9小时和4.1小时，比集胞藻PCC6803稍微快一些。但仍远低于大肠杆菌和酿酒酵母，这将限制蓝细菌用于生物燃料和化学品生产的大规模培养。最近分离得到的聚球藻UTEX2973(SynechococcuselongatusUTEX2973，简称Syn2973)。在BG-11，41℃，500μmolphotons·m-2·s-1和3％二氧化碳培养条件下，Syn2973的倍增时间可以达到1.9小时，接近酿酒酵母的倍增时间(1.67小时)。由于淡水紧缺，利用海水进行蓝细菌大规模培养未来不可避免，而Syn2973作为淡水蓝藻，对盐胁迫敏感，高浓度盐显著抑制了Syn2973的生长。因此，提高Syn2973的耐盐性是今后利用其作为自养光合微生物细胞制造厂的迫切需要。在不耐盐菌株中合成相容溶质是提高宿主耐盐性的关键策略。相关技术及菌株的创建将对GG的生物合成及提高Syn2973耐盐性具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌。本专利技术的第二个目的是提供一种能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌的构建方法。本专利技术的第三个目的是提供一种能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌在生产甘油葡萄糖苷中的应用。本专利技术的技术方案概述如下：能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)分别构建载体pSI-ggpP，pSI-ggpS和pSI-ggpPS：将pSI-SPE质粒骨架与编码甘油葡萄糖苷-磷酸磷酸酶的基因ggpP连接组装成载体pSI-ggpP；将pSI-SPE质粒骨架与编码甘油葡萄糖苷-磷酸合酶的基因ggpS连接组装成载体pSI-ggpS；以pSI-ggpP为模板，反向PCR扩增得到pSI-ggpP质粒骨架；将pSI-ggpP质粒骨架与从所述载体pSI-ggpS中获得的启动子Ptrc和编码甘油葡萄糖苷-磷酸合酶的基因ggpS连接组装成载体pSI-ggpPS；pSI-SPE质粒骨架核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述基因ggpP的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述基因ggpS的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；(2)构建载体pSI-2522ggpPS：将pSII-CM质粒骨架与编码甘油-3-磷酸甘油脱氢酶的基因Syn7942-2522连接组装成载体pSII-2522；将pSI-ggpPS为模板，反向PCR扩增得到pSI-ggpPS质粒骨架；将pSI-ggpPS质粒骨架与从载体pSII-2522中获得的启动子PCPC560和编码甘油-3-磷酸甘油脱氢酶基因Syn7942-2522连接组装成载体pSI-2522ggpPS；所述pSII-CM质粒骨架的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述基因Syn7942-2522的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；(3)构建下调蔗糖合成载体pSII-drfbA：将pSII-CM质粒骨架与序列PpsbA2M-asrfbA-micC-TrbcL-Pcpc560-hfq连接组装成载体pSII-drfbA；所述PpsbA2M-asrfbA-micC-TrbcL-Pcpc560-hfq核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；(4)将所述载体pSI-2522ggpPS和pSII-drfbA依次转入聚球藻UTEX2973中，获得能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌。上述方法构建的能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌。上述能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌在生产甘油葡萄糖苷中的应用。本专利技术的优点：本专利技术利用合成生物学方法围绕GG(甘油葡萄糖苷)合成的限速问题对聚球藻UTEX2973进行系统的针对性改造，得到一种能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌，实验证明，本专利技术的基因工程菌株最终GG产率为1.3mg/L/H，且在0.5MNaCl条件下，本专利技术的工程菌株生长比对照菌株提高62％。这对利用光合微生物生产GG及提高Syn2973耐盐性具有重要的理论及实际意义。附图说明图1为载体pSI-2522ggpPS图示。图2为载体pSII-drfbA图示。图3为工程菌株和对照菌株(含有空质粒pSI-SPE和pSII-CM)在0.5MNaCl条件下生长曲线。图4为本专利技术工程菌产量分析图。图4-A)为对照菌株的气质分析图谱；图4-B)为工程菌株GG产量分析图谱；图4-C)为GG质谱图谱。具体实施方式本专利技术各实施例使用聚球藻UTEX2973(Synechococcuse本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：/n(1)分别构建载体pSI-ggpP，pSI-ggpS和pSI-ggpPS：/n将pSI-SPE质粒骨架与编码甘油葡萄糖苷-磷酸磷酸酶的基因ggpP连接组装成载体pSI-ggpP；/n将pSI-SPE质粒骨架与编码甘油葡萄糖苷-磷酸合酶的基因ggpS连接组装成载体pSI-ggpS；/n以pSI-ggpP为模板，反向PCR扩增得到pSI-ggpP质粒骨架；/n将pSI-ggpP质粒骨架与从所述载体pSI-ggpS中获得的启动子P

【技术特征摘要】
1.能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)分别构建载体pSI-ggpP，pSI-ggpS和pSI-ggpPS：
将pSI-SPE质粒骨架与编码甘油葡萄糖苷-磷酸磷酸酶的基因ggpP连接组装成载体pSI-ggpP；
将pSI-SPE质粒骨架与编码甘油葡萄糖苷-磷酸合酶的基因ggpS连接组装成载体pSI-ggpS；
以pSI-ggpP为模板，反向PCR扩增得到pSI-ggpP质粒骨架；
将pSI-ggpP质粒骨架与从所述载体pSI-ggpS中获得的启动子Ptrc和编码甘油葡萄糖苷-磷酸合酶的基因ggpS连接组装成载体pSI-ggpPS；
pSI-SPE质粒骨架核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
所述基因ggpP的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
所述基因ggpS的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
(2)构建载体pSI-2522ggpPS：
将pSII-CM质粒骨架与编码甘油-3-磷酸甘油脱氢酶的基因Syn7942-2522连接组装成载体pSII-2522；
将pSI-ggpPS为模板，反向PCR扩增得到pSI-gg...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈磊，崔金玉，孙韬，张卫文，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12