本发明专利技术公开了一种Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒，涉及基因检测技术领域。本发明专利技术公开的Taq DNA聚合酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。采用该Taq DNA聚合酶突变体进行PCR反应可直接以血液样本作为模板进行检测，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强以及准确率高等特点。
【技术实现步骤摘要】
TaqDNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，具体而言，涉及TaqDNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒。
技术介绍
目前不孕不育症困扰着全球约10％-15％的育龄夫妇，其中男性因素约占50％(BushnikTetal.,HumReprod,2012,27:738-746)。引起男性不育的因素众多，除了内分泌激素紊乱、生殖道炎症、精索静脉曲张、免疫异常和理化等因素外，约30％以上由遗传缺陷导致的精子发育障碍而引起(BhasinSetal.,JClinEndocrinolMetab,1994,79:1525-1529；ChangPLetal.,HumanReprod,1999,14:2689-2694)，而Y染色体微缺失是主要的遗传学因素之一(LuddiAetal.,NEnglJMed,2009,360:881-885)。因此，对Y染色体AZF微缺失进行检测具有重要的临床意义：①可为临床上一些病因不明的男性不育患者找出病因；②可为男性不育患者的临床诊疗提供依据和指导。目前，对Y染色体微缺失检测的方法主要包括原位杂交法、基因测序法、PCR凝胶电泳法和实时荧光PCR法。实时荧光PCR法具有操作简便、灵敏度高和自动化程度高，不需要电泳检测和杂交等步骤等优点，是一种高效简单的检测方法。但是，实时荧光PCR法对PCR反应体系要求较高，并且当该方法用于同时检测多位点时，不仅对引物和探针的设计要求较高，而且对TaqDNA聚合酶的特异性、扩增能力和稳定性要求较高，具体而言，传统野生型TaqDNA聚合酶在75-80℃时活性最高，但是在温度较低时，该聚合酶的活性依然存在。这就使得在PCR反应的初始阶段，由于引物的量比模板的量高出很多，在仪器升温过程中，很容易出现引物互搭或引物与模板中的一些非靶点错配的现象，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，形成引物二聚体和非特异性产物。这些引物二聚体和非特异性产物又可以作为引物或模板在以后的PCR循环中继续扩增，使非特异产物不断扩增和累积，如果PCR的循环数较多、扩增子的GC含量较高以及多重PCR体系，也很容易产生引物二聚体和非特异性产物，既降低了目的产物的扩增效率，又影响PCR在检测等方面的应用。针对上述问题，中国专利CN201711391569.5公开了一种用于检测Y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用，所述核酸组合及试剂盒在用于Taqman探针多重荧光PCR检测Y染色体微缺失时具有灵敏度高和特异性强的优点。但进一步研究发现上述核酸组合及试剂盒还可从以下方面进行进一步优化：(1)检测样本为EDTA抗凝全血提取的人类DNA样本，检测前需商业化的试剂盒提取人类基因组DNA，不仅增加了试剂成本及时间成本，而且提取过程中存在因操作不当引起交叉污染或样本混淆的风险，因此有必要进一步优化PCR反应液，以达到无需提取基因组DNA、可直接以血液样本为模板实现Y染色体微缺失准确检测的目的；(2)其Taqman探针多重荧光PCR反应体系中的DNA聚合酶为常规改造的DNA聚合酶，在Taqman探针法荧光PCR反应中，TaqDNA聚合酶需同时具有很好的聚合酶活性和5’-3’外切酶活性，以保证扩增效率以及荧光信号释放的效率，而常规TaqDNA聚合酶改造和修饰方案因专注于提高聚合酶性能而忽视了对外切酶性能的考察，从而抑制其外切酶活性，不利于进行Taqman探针法荧光PCR检测，因此，有必要进一步优化和改造DNA聚合酶，以达到更好的检测效果。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种TaqDNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒，采用该TaqDNA聚合酶突变体进行PCR反应可直接以血液样本作为模板进行检测，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强以及准确率高等特点。本专利技术是这样实现的：一方面，本专利技术提供一种TaqDNA聚合酶突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.25所示。本专利技术提供的TaqDNA聚合酶突变体由来源于嗜热水生菌(Thermusaquaticus)的TaqDNA聚合酶突变所得，其相较于野生型TaqDNA聚合酶(SEQIDNO.28)包含以下28个突变：P6R、P40R、D120A、L156M、P158R、D222G、E267V、E289V、P302H、A335E、A341D、D355V、G396A、V433G、N485T、L498H、E537D、K542T、D625R、E641K、T642I、V669E、Q698E、E708Q、L780R、E790V、P816L和K831R。本专利技术的专利技术人通过对野生型TaqDNA聚合酶的研究对其进行合理的突变改造，在提高其聚合酶性能的同时注重其外切酶活性，使得采用该TaqDNA聚合酶突变体进行PCR反应，其扩增延伸速率高于市场上普通的TaqDNA聚合酶，可大大节约PCR扩增时间，其对血液抗性和PCR抑制剂抗性较高，可直接以血液样本为模板进行高效检测，该TaqDNA聚合酶突变体可用于任意类型的PCR反应(如普通PCR、荧光定量PCR、数字PCR等)，无需核酸提取步骤，具有操作简单、检测时间短、灵敏度高、特异性强、准确率高等优点。另一方面，本专利技术提供一种分离的核酸分子，其编码如上所述的TaqDNA聚合酶突变体。在本专利技术公开了TaqDNA聚合酶突变体的氨基酸序列基础上，本领域技术人员容易获得编码该突变体的核酸序列，这对本领域技术人员来说是容易实现的，因此，任意编码上述突变体的核酸序列都属于本专利技术的保护范围。可选的，在本专利技术的一些实施方案中，上述核酸分子的如SEQIDNO.27中的第1-2496位所示。本专利技术通过对密码子的科学优化和创造性的思考，得到上述核酸分子，采用该核酸分子借助基因工程技术可以获得更高表达水平的TaqDNA聚合酶突变体，提高生产或制备TaqDNA聚合酶突变体的效率。另一方面，本专利技术提供含有上所述的分离的核酸分子的载体。可选的，在本专利技术的一些实施方案中，上述载体为原核表达载体例如pET-28a。需要说明的是，在本专利技术的其他实施方案中，载体的类型是可以根据需要选择的，并不限于本专利技术所述的pET-28a载体。无论何种载体，均属于本专利技术的保护范围。另一方面，本专利技术提供含有上所述的载体的重组细胞。可选的，在本专利技术的一些实施方案中，所述重组细胞为原核细胞，例如为大肠杆菌，例如大肠杆菌细胞E.coliBL21(DE3)。需要说明的是，在本专利技术的其他实施方案中，重组细胞的类型是可以根据需要选择的，并不限于本专利技术所述的E.coliBL21(DE3)。无论何种细胞，均属于本专利技术的保护范围。另一方面，本专利技术还提供一种制备如所述TaqDNA聚合酶突变体的制备方法，其包括：培养如上所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述TaqDNA聚合酶突变体。在本专利技术提供了TaqDNA聚合酶突变体的基础上，本领域技术人员可以采用本领域常规的技术如基因工程技术或化学合成技术获得该TaqDNA聚合酶突变体，无论采用何种技术，其属于本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种TaqDNA聚合酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.25所示。
2.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码如权利要求1所述的TaqDNA聚合酶突变体。
3.含有权利要求2所述的分离的核酸分子的载体。
4.含有权利要求3所述的载体的重组细胞。
5.一种制备如权利要求1所述的TaqDNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，其包括：培养如权利要求4所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述TaqDNA聚合酶突变体。
6.一种用于PCR反应的DNA聚合酶试剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的TaqDNA聚合酶突变体或其复合物。
7.根据权利要求6所述的DNA聚合酶试剂，其特征在于，所述复合物包括所述TaqDNA聚合酶突变体和结合至抗所述TaqDNA聚合酶突变体的纳米抗体和/或DNA结合蛋白；
优选地，所述纳米抗体源自羊驼、小羊驼、亚洲的西亚骆驼、非洲的单峰驼、南美洲的大羊驼或原驼；
优选地，所述DNA结合蛋白源自古细菌；
优选地，所述DNA结合蛋白源自硫化叶菌属；
优选地，所述DNA结合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.26所示；
优选地，所述DNA聚合酶试剂中，所述TaqDNA聚合酶突变体或其复合物的浓度为1-2U/μl；
优选地，所述DNA聚合酶试剂还含有：18-22mMTris-HCl、80-120mMKCl、1-3mM二硫苏糖醇、以及30％-50％甘油。
8.一种用于PCR反应的试剂组，其特征在于，其包括权利要求6或7所述的DNA聚合酶试剂以及PCR反应液。
9.根据权利要求8所述的试剂组，其特征在于，所述PCR反应液含有如下组分中的至少一者：Tris-HCl、dNTPs和金属离子；
优选地，所述金属离子为K+和/或Mg2+；
优选地，所述PCR反应液含有：5-50mMTris-HCl、30～60mMKCl、2～6mMMgCl2、以及100～600μMdNTPs；
优选地，所述PCR反应液还含有如下组分中的至少一者：BSA、寡肽、Brij-58、Tween-20以及甲酰胺；
优选地，所述寡肽为六肽；
优选地，所述寡肽的氨基酸序列为：S-F-K-R-G-T；
【专利技术属性】
技术研发人员：吴诗扬，许嘉森，刘志明，刘芳，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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