一种水中诺如病毒纯化方法技术

一种水中诺如病毒纯化方法，它涉及一种病毒的纯化方法。本发明专利技术要解决现有诺如病毒浓缩方法中浓缩样病毒回收率低和单位体积病毒含量低的问题。纯化方法：一、将水样装入纯化装置；二、用多聚磷酸盐溶液进行洗脱；三、然后进行等电点沉降法处理后离心，重溶后二次浓缩，再提取核酸。本发明专利技术用无机溶剂多聚磷酸盐溶液作为二次浓缩洗脱液，克服了Centricon

【技术实现步骤摘要】
一种水中诺如病毒纯化方法
本专利技术涉及一种病毒的纯化方法。
技术介绍
诺如病毒(NoroViruses)引发的腹泻疾病在发展中国家有显著的致死率，在发达国家也有很高的发病率，其中儿童患者数量最高。由于我国肠道病毒检测研究开展较晚，受限水中病毒分离纯化方法，对环境及生活水中诺如病毒的检测至今没有国家标准方法。在水中病毒分离纯化技术方面，现有技术普遍应用超速离心、电势吸附洗脱结合有机絮凝等方法对水样本进行快速分离浓缩，但是由于不同水质中病毒稀薄程度的差异，需要过滤大量水样本，水中诺如病毒纯化效率制约了后期的分子和细胞水平检测方法，另一方面由于超速离心机等设备的过于昂贵，使得普通检测实验室不具备实验能力，制约了方法的应用。
技术实现思路
本专利技术要解决现有诺如病毒浓缩方法中浓缩样病毒回收率低和单位体积病毒含量低的问题；而提供了一种水中诺如病毒纯化方法，该方法能够高效提取水中诺如病毒，并适用于核酸水平检测。水中诺如病毒纯化方法按以下步骤进行纯化：一、将水样装入纯化装置的存储罐(2)中，闭合顶盖(7)，通入氮气，存储罐(2)内的压力上升至0.7个标准大气压，打开控制阀(17)，使水样通过过滤器(3)流向滤膜支架(4)，待水样全部通过滤膜支架(4)内的正电荷滤膜后停止进样，关闭氮气存储罐(2)，使存储罐(2)内泄压，更换新的存储罐(2)；二、将多聚磷酸盐溶液加入更换后的存储罐(2)内，通入氮气，存储罐(2)内的压力上升至0.7个标准大气压，打开控制阀(17)，使多聚磷酸盐溶液流向滤膜支架(4)进行洗脱，待全部通过滤膜支架(4)内的正电荷滤膜后停止进样，通过放水管(5)收集洗脱液，关闭氮气存储罐(2)，使存储罐(2)内泄压；三、然后进行等电点沉降法处理后离心，重溶后二次浓缩，再提取核酸；即完成诺如病毒的提取；其中，步骤三中二次浓缩按下述步骤进行：A、配制浓度为1％的多聚磷酸盐溶液；B、向CentriconPlus-70离心杯式滤器加入60mL去离子水预润洗，弃滤液；C、倒置离心杯式滤器连接收集管，以800g的离心力离心2min；D、取60mL多聚磷酸盐溶液加入离心杯式滤器，再以1900g的离心力离心10min，弃滤液；E、将重溶的病毒液加入离心杯式滤器，以1900g的离心力离心10min，弃滤液；F、重复步骤E，直至重溶的病毒液全部过滤完毕；G、倒置离心杯式滤器连接收集管，以800g的离心力离心2min，收集样本用MEM培养基将样本稀释。本专利技术用无机溶剂多聚磷酸盐溶液作为二次浓缩洗脱液，克服了Centricon设备过滤堵塞的问题，同时保证洗脱效率和病毒活性，减小了浓缩样本终体积，提高了单位体积内病毒样本含量。附图说明图1是纯化装置结构示意图(顶盖处于闭合状态)；图2是纯化装置顶盖的结构示意图；图3是纯化装置顶盖与存储罐连接示意图(顶盖处于闭合状态)；图1-3中1——氮气压力罐，2——存储罐，3——过滤器，4——滤膜支架，5——放水管，6——压力表，7——顶盖，8——进气管，9——出水管，10——存储罐，11——穹顶，12——弧形缩口，13——密封圈，14——外翻沿，15——耳座，16——杠杆，161——提杆，162——连接杆，163——支撑杆，164——过渡圆弧，17——控制阀。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式水中诺如病毒纯化方法按以下步骤进行纯化：一、将水样装入纯化装置的存储罐(2)中，闭合顶盖(7)，通入氮气，存储罐(2)内的压力上升至0.7个标准大气压，打开控制阀(17)，使水样通过过滤器(3)流向滤膜支架(4)，待水样全部通过滤膜支架(4)内的正电荷滤膜后停止进样，关闭氮气存储罐(2)，使存储罐(2)内泄压，更换新的存储罐(2)；二、将多聚磷酸盐溶液加入更换后的存储罐(2)内，通入氮气，存储罐(2)内的压力上升至0.7个标准大气压，打开控制阀(17)，使多聚磷酸盐溶液流向滤膜支架(4)进行洗脱，待全部通过滤膜支架(4)内的正电荷滤膜后停止进样，通过放水管(5)收集洗脱液，关闭氮气存储罐(2)，使存储罐(2)内泄压；三、然后进行等电点沉降法处理后离心，重溶后二次浓缩，再提取核酸，即完成诺如病毒的提取；其中，步骤三中二次浓缩按下述步骤进行：A、配制浓度为1％的多聚磷酸盐溶液；B、向CentriconPlus-70离心杯式滤器加入60mL去离子水预润洗，弃滤液；C、倒置离心杯式滤器连接收集管，以800g的离心力离心2min；D、取60mL多聚磷酸盐溶液加入离心杯式滤器，再以1900g的离心力离心10min，弃滤液；E、将重溶的病毒液加入离心杯式滤器，以1900g的离心力离心10min，弃滤液；F、重复步骤E，直至重溶的病毒液全部过滤完毕；G、倒置离心杯式滤器连接收集管，以800g的离心力离心2min，收集样本用MEM培养基将样本稀释。本实施方式步骤三G中样本稀释后移至离心管内-70℃保藏备用。本实施方式步骤三所述的等电点沉降法为：利用1.2mol/LHCl调节洗脱液(多聚磷酸盐溶液)的pH值至4.0，然后加入洗脱液0.1％(V/V)的0.5mol/LFeCl3，再用1.2mol/LHCl调节pH值至3.5。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二多聚磷酸盐溶液的pH值为6.5。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：步骤二多聚磷酸盐为多聚磷酸钠溶液，多聚磷酸钠溶液由Na2HPO4、KH2PO4、氨基乙酸和去离子水配制而成，其中Na2HPO4浓度为3.8mmol/L、KH2PO4浓度为6.5mmol/L、氨基乙酸浓度为0.05mol/L。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤三G中样本用MEM培养基将样本稀释至1mL。其它步骤及参数与实施方式三相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点是：步骤三在4℃条件下离心。其它步骤及参数与实施方式一至四之一相同。具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点是：步骤三所述重溶为：在生物安全柜中，小心弃上清，过程中不要悬浮沉淀；然后用10mLPBS小心溶解沉淀，转移至50mL离心管中；再加入带有抗生素的1×MEM至终体积30mL，0.22μM滤器过滤溶液，-70℃保藏备用。其它步骤及参数与实施方式一至五之一相同。具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一的不同点是：具体实施方式一所用纯化装置(专利号：ZL201410234128.4)包括氮气压力罐1、存储罐2、过滤器3和滤膜支架4，其特征在于所述的存储罐2包括罐体10和顶盖7，罐体10设有穹顶11，穹顶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水中诺如病毒纯化方法，其特征在于该方法按以下步骤进行纯化：/n一、将水样装入纯化装置的存储罐(2)中，闭合顶盖(7)，通入氮气，存储罐(2)内的压力上升至0.7个标准大气压，打开控制阀(17)，使水样通过过滤器(3)流向滤膜支架(4)，待水样全部通过滤膜支架(4)内的正电荷滤膜后停止进样，关闭氮气存储罐(2)，使存储罐(2)内泄压，更换新的存储罐(2)；/n二、将多聚磷酸盐溶液加入更换后的存储罐(2)内，通入氮气，存储罐(2)内的压力上升至0.7个标准大气压，打开控制阀(17)，使多聚磷酸盐溶液流向滤膜支架(4)进行洗脱，待全部通过滤膜支架(4)内的正电荷滤膜后停止进样，通过放水管(5)收集洗脱液，关闭氮气存储罐(2)，使存储罐(2)内泄压；/n三、然后进行等电点沉降法处理后离心，重溶后二次浓缩，再提取核酸；即完成诺如病毒的提取；/n其中，步骤三中二次浓缩按下述步骤进行：/nA、配制浓度为1％的多聚磷酸盐溶液；/nB、向Centricon Plus-70离心杯式滤器加入60mL去离子水预润洗，弃滤液；/nC、倒置离心杯式滤器连接收集管，以800g的离心力离心2min；/nD、取60mL多聚磷酸盐溶液加入离心杯式滤器，再以1900g的离心力离心10min，弃滤液；/nE、将重溶的病毒液加入离心杯式滤器，以1900g的离心力离心10min，弃滤液；/nF、重复步骤E，直至重溶的病毒液全部过滤完毕；/nG、倒置离心杯式滤器连接收集管，以800g的离心力离心2min，收集样本用MEM培养基将样本稀释。/n...

【技术特征摘要】
1.一种水中诺如病毒纯化方法，其特征在于该方法按以下步骤进行纯化：
一、将水样装入纯化装置的存储罐(2)中，闭合顶盖(7)，通入氮气，存储罐(2)内的压力上升至0.7个标准大气压，打开控制阀(17)，使水样通过过滤器(3)流向滤膜支架(4)，待水样全部通过滤膜支架(4)内的正电荷滤膜后停止进样，关闭氮气存储罐(2)，使存储罐(2)内泄压，更换新的存储罐(2)；
二、将多聚磷酸盐溶液加入更换后的存储罐(2)内，通入氮气，存储罐(2)内的压力上升至0.7个标准大气压，打开控制阀(17)，使多聚磷酸盐溶液流向滤膜支架(4)进行洗脱，待全部通过滤膜支架(4)内的正电荷滤膜后停止进样，通过放水管(5)收集洗脱液，关闭氮气存储罐(2)，使存储罐(2)内泄压；
三、然后进行等电点沉降法处理后离心，重溶后二次浓缩，再提取核酸；即完成诺如病毒的提取；
其中，步骤三中二次浓缩按下述步骤进行：
A、配制浓度为1％的多聚磷酸盐溶液；
B、向CentriconPlus-70离心杯式滤器加入60mL去离子水预润洗，弃滤液；
C、倒置离心杯式滤器连接收集管，以800g的离心力离心2min；
D、取60mL多聚磷酸盐溶液加入离心杯式滤器，再以1900g的离心力离心10min，弃滤液；
E、将重溶的病毒液加入离心杯式滤器，以1900g的离心力离心10min，弃滤液；
F、重复步骤E，直至重溶的病毒液全部过滤完毕；
G、倒置离心杯式滤器连接收集管，以800g的离心力离心2min，收集样本用MEM培养基将样本稀释。


2.根据权利要求1所述的水中诺如病毒纯化方法，其特征在于步骤二多聚磷酸盐溶液的pH值为6.5。


3.根据权利要求1所述的水中诺如病毒纯化方法，其特征在于步骤二多聚磷酸盐为多聚磷酸钠溶液，多聚磷酸钠溶液由Na2HPO4、KH2PO4、氨基乙酸和去离子水配制而成，其中Na2HPO4浓度为3.8mmol/L、KH2PO4浓度为6.5mmol/L、氨基乙酸浓度为0.05mol/L。


4.根据权利要求1所述的水中诺如病毒纯化方法，其特征在于步骤三G中样本用MEM培养基将样本稀释至1mL。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晓龙，赵焱，郑成志，李芯蕊，陈洪岩，张珊珊，谢飞，
申请(专利权)人：哈尔滨北方环境检测有限公司，哈尔滨工业大学水资源国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23