一种重组大肠杆菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及基因工程菌株的构建，尤其是一种重组大肠杆菌及其构建方法与应用。该重组大肠杆菌中敲除了磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ，重组表达了manB、manC、gmd、wcaG、srlD基因，还进一步重组表达了pntAB基因、ndK基因、gsK基因，并敲除了pfkA基因，从而增强了对山梨醇催化分解形成6‑磷酸果糖的合成路径，同时弱化了6‑磷酸果糖的糖酵解过程，有助于6‑磷酸果糖的积累，进而为GDP‑L‑岩藻糖的合成提供更多的前体物质；另外，对辅助因子NADPH和GTP的再生强化，有助于进一步提高重组大肠杆菌菌株生产GDP‑L‑岩藻糖的能力。

【技术实现步骤摘要】
一种重组大肠杆菌及其构建方法与应用
本专利技术属于生物工程
，涉及基因工程菌株的构建，尤其是一种重组大肠杆菌及其构建方法与应用。
技术介绍
鸟苷5'-二磷酸-L-岩藻糖(GDP-L-岩藻糖)作为一种L-岩藻糖的供体，是岩藻糖基化寡糖的生物合成过程中至关重要的底物。然而，GDP-L-岩藻糖的低生产水平和高成本限制了其在岩藻糖基寡糖的大规模生产中的应用。在现有技术方案中，对于供体底物GDP-L-岩藻糖的生物合成目前已经确定有两种途径：从头途径(Denovopathway)和救助途径(Salvagepathway)。从头合成途径(Denovopathway)主要起源于细菌的中央代谢活动，GDP-L-岩藻糖的合成路径主要以糖酵解中间产物6-磷酸果糖为起点，依次经过ManA(mannose6-phosphateisomerase，甘露糖-6-磷酸异构酶)，ManB(phosphomannomutase，磷酸甘露糖变位酶)，ManC(α-D-mannose-phosphateguanylyltransferase，α-D-甘露糖-磷酸鸟嘌呤基转移酶)，Gmd(GDP-mannose-4,6-dehydratase，GDP-甘露糖4,6-脱氢酶)和WcaG(GDP-L-fucosesynthase，GDP-L-岩藻糖合成酶)五个酶促反应步骤，生成中间体GDP-L-岩藻糖。整个反应过程中，需要鸟苷5'-三磷酸(GTP)和NADPH作为辅因子。在此基础上，只要外源引入特定的岩藻糖基转移酶和受体糖底物，理论上就能催化合成所需的岩藻糖基化寡糖。另外，GDP-L-岩藻糖本身可以参与荚膜异多糖酸的生物合成，作为细胞壁的主要成分。补救合成途径(Salvagepathway)最初源于哺乳动物细胞和一些拟杆菌的代谢系统。该途径从L-岩藻糖开始，胞外L-岩藻糖被转移到细胞内，再依次通过L-岩藻糖激酶和GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶的催化作用合成GDP-L-岩藻糖。目前已经公开了一种来源于脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)的双功能酶(Fkp)可以同时含有L-岩藻糖激酶活性和GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶活性，这无疑促进了GDP-L-岩藻糖代谢工程化合成的可行性。整个反应过程中，需要ATP和GTP作为辅因子。从合成路径上看，补救合成路径要相对简单，但是所需要的底物L-岩藻糖极难获得，且市场价格较高，因此该方案目前还不适合规模化的GDP-L-岩藻糖制备。在野生型大肠杆菌中，通过葡萄糖的分解代谢就能合成GDP-L-岩藻糖，但受分解代谢物阻遏效应影响其生产水平有限，使得以葡萄代谢产生的GDP-L-岩藻糖仅供野生型大肠杆菌自身所需，而难以进行大量积累。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种利用山梨醇高产GDP-L-岩藻糖的重组大肠杆菌以及该重组大肠杆菌的构建方法，利用构建的重组大肠杆菌发酵合成GDP-L-岩藻糖为本专利技术的另一个目的。此外，本专利技术在高产GDP-L-岩藻糖的重组大肠杆菌的基础上构建了一种利用山梨醇为碳源高产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌株，并利用该工程菌株发酵合成2’-岩藻糖基乳糖。基于上述目的，本专利技术采用如下技术方案：第一方面，本专利技术构建了如下五种利用山梨醇高产GDP-L-岩藻糖的重组大肠杆菌。第一种重组大肠杆菌在原始大肠杆菌的基础上，敲除了磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ，同时过表达磷酸甘露糖变位酶基因manB、α-D-甘露糖1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖4,6-脱氢酶基因gmd、GDP-L-岩藻糖合成酶基因wcaG。通过敲除WcaJ基因，使得以GDP-L-岩藻糖为前体合成夹膜异多糖酸的合成路径失活，有助于GDP-L-岩藻糖的合成积累；通过过表达磷酸甘露糖变位酶基因manB(GeneID：946574)、α-D-甘露糖1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC(GeneID：946580)、GDP-甘露糖4,6-脱氢酶基因gmd(GeneID：946562)、GDP-L-岩藻糖合成酶基因wcaG(GeneID：946563)，促进从头合成路径的过表达，促进6-磷酸果糖合成GDP-L-岩藻糖，从而有助于GDP-L-岩藻糖的合成积累。第二种重组大肠杆菌在第一种重组大肠杆菌的基础上进一步过表达山梨醇-6-磷酸脱氢酶基因srlD(GeneID：948937)，利用山梨醇-6-磷酸脱氢酶将山梨醇分解为6-磷酸果糖，为GDP-L-岩藻糖的合成积累提供更多的前体物质。第三种重组大肠杆菌在第二中重组大肠杆菌的基础上，进一步过表达吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB(GeneID：946228和946144)，通过吡啶核苷酸转氢酶强化NADPH再生，这是由于山梨醇代谢产生的还原力NADH，在吡啶核苷酸转氢酶的作用下转化成辅因子NADPH，吡啶核苷酸转氢酶的活性决定了大肠杆菌中胞质NADPH的主要来源，能够将NADH可逆的NADP还原与跨膜的内向质子移位偶联，通过吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB的过表达，增强NADPH再生，促进GDP-L-岩藻糖的合成。第四种重组大肠杆菌在第三种重组大肠杆菌的基础上，还进一步过表达核苷二磷酸激酶基因ndK(GeneID：945611)和肌苷-鸟苷激酶基因gsK(GeneID：946584)，核苷二磷酸激酶和肌苷-鸟苷激酶有助于上调辅因子GTP的合成，从而进一步提升了GDP-L-岩藻糖的合成能力。第五种重组大肠杆菌在第四种重组大肠杆菌的基础上，敲除了6-磷酸果糖激酶I基因pfkA。6-磷酸果糖激酶为6-磷酸果糖参与糖酵解的关键酶之一，通过敲除6-磷酸果糖激酶I基因pfkA，能够弱化6-磷酸果糖的糖酵解过程，有助于6-磷酸果糖的积累，为GDP-L-岩藻糖的合成提供更多的前体物质。第二方面，本专利技术提供了上述重组大肠杆菌的构建方法，具体如下。第一种～第四种重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：(1)敲除大肠杆菌中磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ，获得wcaJ基因敲除的大肠杆菌菌株；(2)构建过表达磷酸甘露糖变位酶基因manB(GeneID：946574)，α-D-甘露糖1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC(GeneID：946580)，GDP-甘露糖4,6-脱氢酶基因gmd(GeneID：946562)和GDP-L-岩藻糖合成酶基因wcaG(GeneID：946563)的重组质粒pRSF-manC-manB-gmd-wcaG；将该重组质粒转入wcaJ基因敲除的大肠杆菌菌株中，得到从头合成途径过表达的大肠杆菌菌株；(3)构建山梨醇-6-磷酸脱氢酶基因srlD(GeneID：948937)的重组质粒pET-srlD，并将重组质粒pET-srlD和pRSF-manC-manB-gmd-wcaG共转入wcaJ基因敲除的大肠杆菌菌株，得到山梨醇分解代谢增强的大肠杆菌菌株；(4)将吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB片段插入重组质粒pET-srlD，获得重组质粒pET-srlD-pntAB，将重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌在原始大肠杆菌的基础上敲除了磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ，同时过表达磷酸甘露糖变位酶基因manB、α-D-甘露糖1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖4,6-脱氢酶基因gmd、GDP-L-岩藻糖合成酶基因wcaG、山梨醇-6-磷酸脱氢酶基因srlD。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌在原始大肠杆菌的基础上敲除了磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ，同时过表达磷酸甘露糖变位酶基因manB、α-D-甘露糖1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖4,6-脱氢酶基因gmd、GDP-L-岩藻糖合成酶基因wcaG、山梨醇-6-磷酸脱氢酶基因srlD。


2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌在权利要求1的基础上做了如下改造：过表达吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB。


3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌在权利要求2的基础上做了如下改造：过表达核苷二磷酸激酶基因ndK和肌苷-鸟苷激酶基因gsK。


4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌在权利要求3的基础上做了如下改造：敲除了6-磷酸果糖激酶I基因pfkA。


5.一种权利要求3所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)敲除大肠杆菌中磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ，获得wcaJ基因敲除的大肠杆菌菌株；
(2)构建过表达磷酸甘露糖变位酶基因manB，α-D-甘露糖1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC，GDP-甘露糖4,6-脱氢酶基因gmd和GDP-L-岩藻糖合成酶基因wcaG的重组质粒pRSF-manC-manB-gmd-wcaG；将该重组质粒转入wcaJ基因敲除的大肠杆菌菌株中，得到从头合成途径过表达的大肠杆菌菌株；
(3)构建山梨醇-6-磷酸脱氢酶基因srlD的重组质粒pET-srlD，并将重组质粒pET-srlD和pRSF-m...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪志坚，陈祥松，吴金勇，廖迎雪，李忠奎，袁丽霞，李翔宇，王纪，姚建铭，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，武汉中科光谷绿色生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34