一种用于生产香紫苏二醇的菌株组合、应用及生产香紫苏二醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于生产香紫苏二醇的菌株组合、应用及生产香紫苏二醇的方法。一种用于生产香紫苏二醇的菌株组合，由酿酒酵母工程菌和保藏号为ATCC 20624的真菌组成，所述酿酒酵母工程菌中外源表达焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶和香紫苏醇合酶。本发明专利技术与现有技术相比其显著优点是：1、酵母自身代谢途径可以提供合成香紫苏醇的前体GGPP，通过引入两个外源基因即可实现香紫苏醇的微生物合成法，为生产香紫苏二醇提供原料。2、在共培养体系中，真菌ATCC 20624以酵母产生的香紫苏醇为底物，将其转化为香紫苏二醇，因此可以实现香紫苏二醇的从头生物合成。3、真菌ATCC 20624对香紫苏醇的转化，能够进一步促进酵母生产香紫苏醇。

【技术实现步骤摘要】
一种用于生产香紫苏二醇的菌株组合、应用及生产香紫苏二醇的方法
本专利技术涉及合成生物学
，特别是涉及一种用于生产香紫苏二醇的菌株组合、应用及生产香紫苏二醇的方法。
技术介绍
香紫苏二醇(Sclareolglycol)是合成(-)-降龙涎醚((-)-ambrox)的重要中间体。降龙涎醚被认为是天然动物香料龙涎香的气味原型，具有一种独特的温和、细腻、令人愉悦的麝香性动物香韵，最能体现龙涎香特征。目前，(-)-降龙涎醚的工业生产方法主要是以香紫苏醇为原料的半合成路线，从植物香紫苏(Salviasclarea)中提取得到的香紫苏醇(Sclareol)具有和(-)-降龙涎醚相似的碳原子骨架。通过氧化剂进行香紫苏醇侧链的氧化生成香紫苏内酯(sclareolide)，然后经还原制得香紫苏二醇,最后在酸性条件下，脱水环化生成(-)-降龙涎醚。这个合成路线存在的主要问题包括：以香紫苏为原料获得香紫苏醇需要经过提取、纯化等步骤且香紫苏生长周期长、受环境因素影响大；现阶段的化学合成法或路线长，或合成过程需要昂贵的试剂，或部分工艺存在三废问题(MoulinesJ,Jean-PaulBats,Anne-MarieLamidey,etal.AboutaPracticalSynthesisofAmbroxfromSclareol:aNewPreparationofaKetoneKeyIntermediateandaCloseLookatitsBaeyer–VilligerOxidation[J].ChemInform,2005,36(87):2695-2705.)；此外，(-)-降龙涎醚作为调香剂和定香剂，可以替代天然龙涎香，应用于高端香水和香烟中，由化学方法生产的(-)-降龙涎醚可能存在化学杂质残留而影响香气特征及其应用的安全性。近年来，生物法生产降龙涎醚中间化合物引起了人们的重视。瑞典科研人员(SchalkM,PastoreL,MirataMA,etal.Towardabiosyntheticroutetosclareolandamberodorants.[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2012,134(46):18900-3.)发现了南欧丹参(Salviasclarea)中合成香紫苏醇的两个关键酶，焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶(SsLPPs3)和香紫苏醇合酶(SsTPs1132)，分别催化香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)生成焦磷酸赖百当烯二醇酯(LPP)及LPP生成香紫苏醇的反应，并以大肠杆菌为宿主构建了香紫苏醇的生物合成途径，结合高密度发酵技术，香紫苏醇的产量达到1.5g/L。FarboodMI等发现Cryptococcusalbidus以香紫苏醇为底物发酵可将其转化为香紫苏内酯(FarboodMI,MorrisJA,DowneyAE.Processforproducingdiolandlactoneandmicroorganismscapableofsame[J].1990.)，而HyphozymaroseonigraATCC20624则能够将香紫苏醇降解为降龙涎二醇(FarboodMI,WillisBJ.Processforproducingdiolandfuranandmicroorganismcapableofsame:US1989.)。但是，目前还没有直接以葡萄糖为碳源，通过生物法生产香紫苏二醇的相关研究。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种用于生产香紫苏二醇的菌株组合、应用及生产香紫苏二醇的方法。一种用于生产香紫苏二醇的菌株组合，由酿酒酵母工程菌和保藏号为ATCC20624的真菌组成，所述酿酒酵母工程菌中外源表达焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶和香紫苏醇合酶。优选的，酿酒酵母工程菌的构建步骤如下：(1)将核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因(OtSsLPPs3)和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的香紫苏醇合酶基因(OtSsTPs1132)转入底盘酿酒酵母YXWP120中进行表达；(2)将步骤(1)所得酿酒酵母中启动Erg9基因表达的启动子替换为弱启动子pHXT1，实现Erg9基因表达的下调；(3)将步骤(2)所得酿酒酵母中的rox1基因敲除，获得所述酿酒酵母工程菌。优选的，共培养时，真菌ATCC20624与所述酿酒酵母工程菌的菌量混合比例为1∶2～2∶1。本专利技术又提供了所述菌株组合在生产香紫苏二醇中的应用。本专利技术还提供了一种生产香紫苏二醇的方法，使用所述菌株组合进行发酵培养，生产香紫苏二醇。分别将酿酒酵母工程菌和保藏号为ATCC20624的真菌进行发酵培养获得预培养液，真菌ATCC20624预培养时外源添加0.05-0.15g/L香紫苏醇作为诱导剂，然后将两种菌株的预培养液混合后进行共培养。发酵培养结束后，发酵液用乙酸乙酯萃取分离香紫苏二醇，萃取后取乙酸乙酯所在部分进行旋转蒸发，获得香紫苏二醇。本专利技术与现有技术相比其显著优点是：1、酵母自身代谢途径可以提供合成香紫苏醇的前体GGPP，通过引入两个外源基因即可实现香紫苏醇的微生物合成法，为生产香紫苏二醇提供原料。2、在共培养体系中，真菌ATCC20624以酵母产生的香紫苏醇为底物，将其转化为香紫苏二醇，因此可以实现香紫苏二醇的从头生物合成。3、真菌ATCC20624对香紫苏醇的转化，能够进一步促进酵母生产香紫苏醇。附图说明图1是酵母整合型质粒pUMRI-10图谱。图2是质粒pUMRI-12-HXT1-ERG9-TEF1图谱。图3是是质粒PESC-URA-HI-PTEF1-Cas9-rox1-knockout图谱。图4是香紫苏醇标准品与本专利技术所构建的酿酒酵母基因工程菌株发酵液萃取物的液相图。图5是香紫苏二醇标准品、ATCC20624单独发酵以及酿酒酵母和ATCC20624共培养萃取物的液相图。图6是本专利技术中酿酒酵母工程菌株与真菌ATCC20624共培养体系构建的流程图。具体实施方式实施例1：产香紫苏醇酿酒酵母菌株的构建用密码子优化软件将来源于南欧丹参的焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶(GenBank号：JN133923.1)和香紫苏醇合酶(GenBank号：JN133922)进行以酿酒酵母为宿主的密码子优化，并人工合成优化后的序列。通过信号肽在线预测网站对基因进行截短，即OtSsLPPs3和OtSsTPs1132。利用下列引物：OtTpsSa3-BamHI-F：GGATCCATGGCTTCACAAGCATCAGAAAA；OtTpsSa3-XhoI-R：CTCGAGTTAAACAACTGGTCTAAACAAAACT；OtSsTps1132-EcoRI-F：GAATTCATGATGGCTAAAATGAAAGAAAATTT；OtSsTps1132-SpeI-R：ACTAGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生产香紫苏二醇的菌株组合，其特征在于，由酿酒酵母工程菌和保藏号为ATCC 20624的真菌组成，所述酿酒酵母工程菌中外源表达焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶和香紫苏醇合酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于生产香紫苏二醇的菌株组合，其特征在于，由酿酒酵母工程菌和保藏号为ATCC20624的真菌组成，所述酿酒酵母工程菌中外源表达焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶和香紫苏醇合酶。


2.如权利要求1所述的菌株组合，其特征在于，酿酒酵母工程菌的构建步骤如下：
(1)将核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的香紫苏醇合酶基因转入底盘酿酒酵母YXWP120中进行表达；
(2)将步骤(1)所得酿酒酵母中启动Erg9基因表达的启动子替换为弱启动子pHXT1，实现Erg9基因表达的下调；
(3)将步骤(2)所得酿酒酵母中的rox1基因敲除，获得所述酿酒酵母工程菌。


3.如权利要求1所述的菌株组合，其特征在于，共培养时...

【专利技术属性】
技术研发人员：于洪巍，叶丽丹，何霓，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33